顕微蛍光セルマニピュレーターを用いた細胞の選択的分離培養法に関する研究

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本研究は、微生物の新規分離法である『顕微蛍光セルマニピュレーターを用いた1細胞分離培養法』の確立を目的とした。手法実用化のためには、1)本手法が高い成功率を有する(1細胞分取培養後に高い細胞増殖率を確約する)手法であること、2)ターゲット細胞(例えば特定の機能を有する微生物等)を選択的に分取・培養可能な手法であること、が重要である。1)の実現のため、モデル微生物としてE. coli JM109ならびにB. coagulans(T)の純粋培養系を用い、試薬、器具、操作手順を検討・改良し『ドロップレット液系分離法』とした。次に、生細胞選択的分取法として、①エステラーゼ活性によるCFDA-AMの蛍光を指標として生理活性を有する生細胞のみを識別・分取する方法、②DVC(Direct Viable Count)法による細胞形態変化(伸長肥大)を指標として増殖能を有する細胞のみを識別・分取する方法、を検証した。1細胞分離培養後の細胞増殖率を、未染色細胞、CFDA-AM染色細胞、DVC-CFDA-AM染色細胞において調べた結果、E. coliでは、それぞれ86.7%、57.1%、19.0%となり、特に未染色細胞において高い分離成功率が確認された。B. coagulansでは、それぞれ0%、63.6%、0%となり、CFDA-AM染色が分離成功率向上に有効であることが示された。一方、DVC法は分離時の操作性を向上させるが、増殖成功率を低下させた。次に、2)の実現のため、糖分解性を指標とした分取法を検証した。β-グルコシダーゼ検出用蛍光基質[9-(4′-methoxy-2′-methylphenyl)-6-(β-D-glucopylanosyloxy)-xanthen-3-one]を用い、キシラン分解性β-グルコシダーゼ活性を有するB. hisashii N-11を特異的に染色した。その染色細胞の分離成功率は0%であり、また、未染色細胞における分離成功率も0%となった。そこで、顕微鏡加温冷却ステージを用い、至適温度環境下で未染色細胞の分離を行った結果、11.1%と若干の向上が見られた。好熱性細菌であるB. hisashiiは、分離操作時の温度環境による影響を受けた可能性があり、今後、ターゲット細菌の培養特性に合わせた手法改良が必要であることが示された。