血中cell free EBERの臨床検査応用へ向けた測定条件の確立

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本研究では、リアルタイムRT-PCR法でのEBER定量時の検体の保存条件と臨床検体を想定した場合の血清成分の影響を検討し、適切な検体保存条件を決定することを目的とした。まずEBER定量時の保存条件を検討するためにEBV感染細胞株であるNamalwa細胞培養上清の凍結・融解がEBER定量に及ぼす影響と保存条件(室温、4℃、-80℃)でどの程度の期間EBERが安定かについて実験した。培養上清採取直後のRNA抽出と培養上清を1回-80℃で凍結融解後のRNA抽出を比較すると、有意差は認めなかったが凍結融解後のEBER定量値は減少し、減少率の平均は76.7%(68.9%～82.1%)であった。したがって培養上清を凍結保存すると大幅にEBERの値を減少させる傾向があることが分かった。室温もしくは4℃の保存では72時間までEBER定量値の減少は認めず、特に4℃での保存では、3日、1週間、1ヶ月後の定量値に有意な減少は認められなかった。次に、プール血清をNamalwa培養上清に添加することで、RNA抽出やEBER定量に血清成分が及ぼす影響を検討した。培養上清を血清で10倍希釈したmixサンプルをすぐにRNA抽出した場合とmixサンプルを1回-80℃で凍結融解後にRNAを抽出した場合のEBER定量値を比較すると、凍結融解後のEBER定量値は減少し、減少率の平均は24.6%(13.1%～35.4%)であった。培養上清をそのまま凍結融解した場合と比較してEBERの減少幅は少なかった。したがって、血清成分中にEBERを安定して保存する効果があるか、EBERの抽出効率を高める可能性が考えられた。これらの結果より、EBER定量時の検体保存条件として凍結融解を避け、4℃保存する事で少なくとも1ヶ月間は安定したデータが得られることが示唆された。