LST-2機能とraftの関係の解明

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目的:本研究は、細胞膜上に浮かぶ舟様の「Lipid microdomain」あるいは「raft」(以下raftに統一)と呼ばれる新しい膜構造の概念を応用し癌細胞の多剤耐性阻止を目指すものである。トランスポーターLST-2は、抗癌剤を癌細胞内に特異的に取り込むことで抗癌剤の感受性を高めることが明らかとなりつつある。そこで、LST-2の活性化におけるRaftとnon-raft間の移動制御システムを解明する。方法:100%コンフリートした状態のLST-2安定発現細胞に100μMメソトレキセート(MTX)を20分添加した群、10μM Dimethyl-β-cyclodextrin(DM-β-CD)を20分添加した群、両薬剤を20分添加した群及び無添加の群を作成した。それぞれの群をPBSにて3回洗い、TNE(20mM Tris-HCL,pH7.4,150mM NaCl,1mMEDTA,1%TritonX100,protease inhibitors)を用いて細胞を回収し、ホモジネートを行った。さらに、80%スクロースにホモジネートしたものを溶解し、さらに35%スクロース液、5%スクロース液を重層し、Beckman SW41rotorを用いて4℃,38,000rpmで15時間遠心分離を行った。遠心分離後、1mLずつフラクションを作成し、各々の群のフラクションをSDS-PAGEにてウェスタンブロットを行い一次抗体として、モノクロナール抗体(MA3-935)(50倍希釈)、2次抗体としてHRP標識抗マウス抗体(10000倍希釈)を用いた。検出はECL Plus Wesrern Blotting Detection Reagentsを加え化学発光させ、X線フィルムを用いて行った。結果・考察:遠心分離を行い、既に文献にてraft領域とされる部分を各々の群で、2番目のフラクションに得た。さらに、2番目のフラクションにLST-2が検出されるとされている116kDa付近にバンドが濃く検出された。しかしながら、各群におけるバンドの濃淡については、殆ど差がなかった。以上のことから、raft領域の分画によるLST-2の抽出はできたものの、MTX及びDM-β-CDによるLST-2のraft領域への移動を示唆する結果とはならなかった。