消化器固形癌特異的発現トランスポーターLST-2を用いた癌指向性抗癌剤の開発

利用胃肠道实体瘤特异性表达转运蛋白LST-2开发癌症定向抗癌药物

基本信息

批准号：
13218011
负责人：
阿部高明
金额：
$ 4.74万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

申請者は最近単離した新規有機アニオントランスポーターLST-1に引き続きLST-2を世界に先駆けて単離した。LST-2は正常ヒト肝臓のみに弱く発現していたが胃癌、大腸癌、膵臓癌において多量に発現していた。各種発現系の結果からLST-2はMTXを飽和的にかつ濃度依存的に輸送し培養細胞へのLST-2遺伝子の導入は細胞のMTXに対する感受性を高めることが明らかとなった。本研究ではアデノウイルスを用いたLST-2強制発現細胞を作製し、その発現細胞に取り込まれる蛍光標識物質の蛍光強度に対する各種薬物の阻害効率を指標に消化器固形癌指向性薬物の探索を目的とする。我々はアデノウイルスを用いたトランスポーターの強制発現系を樹立し、蛍光マイクロタイタープレートを用いてLST-2で輸送される蛍光基質の取り込みの抑制を指標とした消化器固形癌指向性薬物のスクリーニング系の開発を行った。動物細胞で働くCAGプロモーターを含むcosmid vector, pAxCAwtにLST-1,LST-2c DNAの翻訳領域を挿入、アデノウイルスゲノムDNAと共にリン酸カルシウム法でHEK293細胞にcotransfectionし、LST-1,LST-2組み換えアデノウイルス(AdLST-1,AdLST-2)を得た。AdLST-1,AdLST-2を各種細胞株に感染させ、放射線標識体の取り込み実験を行った。AdLST-1,AdLST-2を感染させたHepG2,PLC/PRF/5,HT17で[3H]-タウロコール酸(TCA)の取り込みを検討したところ、コントロールに対して最大36.7倍の有意な取り込みが認められた。AdLST-1,AdLST-2の感染により発現したLST-1及びLST-2は共に濃度依存的、飽和的にTCAを取り込んだ。また、ケノデオキシコール酸(CDCA)はLST-2によって濃度依存的飽和的に取り込まれ、そのKm値は0.66+0.11μMであり非常に親和性の高い基質であることがわかり、機能的にも効果的に細胞にLST-2を導入することが可能になった。

申请人遵循最近孤立的新型有机阴离子转运蛋白LST-1，然后是世界上第一个在LST-2的世界中隔离。 LST-2仅在正常的人肝脏中弱表示，但在胃，结肠和胰腺癌中高度表达。各种表达系统的结果表明，LST-2以饱和和浓度依赖的方式传输MTX，并且将LST-2基因引入培养细胞中会增加细胞对MTX的敏感性。在这项研究中，我们旨在利用抑制各种药物在掺入表达细胞的荧光标记物质的荧光强度上抑制各种药物的效率，以使用腺病毒来表达强制表达LST-2细胞。我们使用腺病毒建立了一种用于转运蛋白的强制表达系统，并使用荧光微量滴定板开发了一种用于固体胃肠道癌热带药物的筛查系统，以表明抑制LST-2运输的荧光底物的摄取。 LST-1和LST-2C DNA的翻译区域被插入cosmid载体中，PaxCawt包含在动物细胞中起作用的CAG启动子，并通过磷酸钙磷酸钙与腺病毒基因组DNA一起通过磷酸钙方法共转染，以获得LST-1和LST-2重组腺病毒（ADLST-1和ADLST-1和ADLST-1和ADLST-1和ADLST-2）。各种细胞系被ADLST-1和ADLST-2感染，并进行了实验以掺入放射性标记的身体。当研究[3H] - ta胆胆酸（TCA）的ADLST-1和ADLST-2感染HEPG2，PLC/PRF/5和HT17时，与对照相比，观察到高达36.7次的大量吸收。通过ADLST-1和ADLST-2感染表达的LST-1和LST-2都以浓度依赖性的方式进行了TCA。此外，通过LST-2掺入了Chendexyoxycholic Acid（CDCA）的浓度依赖性饱和度，其KM值为0.66 +0.11μm，发现这是高度亲和力的底物，从而可以有效地将LST-2在功能上引入LST-2。