組織微細形態と抗原性の保持に優れた透過電子顕微鏡用の固定包埋法の開発

开发用于透射电子显微镜的固定包埋方法，该方法在保留组织微形态和抗原性方面表现出色

• 批准号: 20929019
• 负责人: 楢崎 正博
• 金额: $ 0.35万
• 依托单位: Okayama University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Scientists
• 财政年份: 2008
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2008 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20929019/
• 关键词: 透過電子顕微鏡; 免疫染色; 凍結置換法

本研究は、微細構造と抗原性の保持に優れ、かつ様々な組織・抗体に適用できる透過電子顕微鏡のPost-embedding法(超薄切片上での免疫染色を行うこと)用の包埋法の開発を目的とし、以下の包埋剤を検討した。これまで、固定液ではパラホルムアルデヒド(PFA)と少量のグルタルアルデヒド(GA)の混合比を変えることにより、両方の目的を可能にする固定包埋法の検討をおこなってきたが、今回はGAを使用せず、PFAによる方法で、マウスの視神経、大脳、小腸、腎臓、筋肉の組織試料を固定した。免疫染色包埋樹脂はLR White、LR Gold、Lowicryl K4M、テクノビット7200VLC、Lowicryl HM20を用いて、それぞれの定法に従って試料作製をおこない、光学顕微鏡(Toluidinblue染色)と透過電子顕微鏡(ウラン鉛染色・免疫染色)で微細構造に差がないか比較観察をおこなった。また、免疫染色では、大脳と腎臓のみでラット抗IV型コラーゲンα鎖抗体(H22,H31,H53、重井医学研)及びウサギ抗アクアポリン抗体(Santa Cruz)染色での金コロイドの分布状態において抗原性の比較検討をおこなった。以上の実験検討をおこなった結果、微細構造と抗原性に優れた包埋方法としては、Lowicryl HM20>LR White>LR Gold>Lowicryl K4M>テクノビット7200VLCという順番となった。次に、良好な結果であったLowicryl HM20凍結置換包埋において、置換剤(メタノール)に使用する添加剤について検討した。酢酸ウラン(UA)やタンニン酸(TA)などを使用する方法があるが、今回は新しくTIブルー、シトラコン酸、メタ過ヨウ素酸ナトリウム(NalO4)を試みた。TIブルーは、UA同様に像のコントラスト・抗原の保存性は良好だが、組織への浸透性が悪かった。シトラコン酸は、酸の影響により微細構造が少し悪くなるが抗原の保存性は良好であった。NalO4は、微細構造・抗原の保存性は最も良好だった。この試薬は有機溶媒には溶けにくいとされているが、何らかの効果(浸透性あるいは酸化作用)があると考えられる。検討の結果、急速凍結後に凍結置換包埋がおこなえるLowicryl HM20樹脂包埋で、NalO4だけを添加剤として使用する方法または、NalO4とUA(コントラスト向上)を併用する方法が有効であることがわかった。

The purpose of this study is to investigate the development of micro-embedding methods by electron microscopy Post-embedding (immunostaining on ultra-thin sections) for the preservation of fine structure and antigenicity, as well as the application of tissue and antibody. The fixative solution was prepared by changing the mixing ratio of PFA and GA. The fixative solution was prepared by using GA and PFA. The fixative solution was prepared by fixing tissue samples from kidney, intestine, kidney and muscle. Immunostaining Embedding Resins LR White, LR Gold, Lowicryl K4M, Tockvit 7200VLC, Lowicryl HM20, etc. Use the same method for sample preparation, optical microscopy (Toluidinblue staining), electron microscopy (lead staining, immunostaining), microstructural analysis, comparative observation, etc. The distribution of the protein was studied by immunostaining with anti-type IV antibodies (H22,H31,H53, Shigei Medical Research Institute) and anti-type IV antibodies (Santa Cruz). The results of the above discussion, fine structure and antigenicity, excellent embedding methods, Lowicryl HM20>LR White>LR Gold>Lowicryl K4M> Tequila 7200VLC Second, good results were obtained by using the Lowicryl HM20 Freezing Substitution Embedding and Substitution Agent. A new method for the use of acid (UA) and acid (TA) is proposed, and this method is now used to test the use of acid (UA) and acid (TA). TI, UA, and the like. The preservation of the antigen is good, and the permeability of the tissue is good. The preservation of the antigen is good due to the influence of acid and acid on the microstructure. NalO4, fine structure and antigen preservation are the best. The organic solvent is dissolved in water, and the organic solvent is dissolved in water. The results of this study include: rapid freezing followed by freezing replacement embedding with Lowicryl HM20 resin embedding, NalO4 addition, and NalO4 UA(upward).