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PCR-RFLP法を用いたミトコンドリアDNA多型解析方法の検討

利用PCR-RFLP法检测线粒体DNA多态性分析方法

基本信息

批准号：
23930001
负责人：
石橋佳朋
金额：
$ 0.26万
依托单位：
東武医学技術専門学校
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Scientists
财政年份：
2011
资助国家：
日本
起止时间：
2011 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-23930001/
关键词：
ミトコンドリアDNA ハプログループ

项目摘要

【目的】ミトコンドリアDNA(以下、mtDNA)は、核DNAよりも5～10倍早く変異し、母糸遺伝するため、集団遺伝学の研究対象として用いられる。2004年Tanaka^<1)>らにより、東アジアから日本を対象に、mtDNAの全塩基配列を用いたハプログループの分類が行われた。本研究では、このハプログループの分類が、mtDNAの全塩基配列を調べることなく、PCR-RFLP法のみで行えないか検討を行うことを目的としている。【方法】1.mtDNAは、静脈血より、EZNA Blood DNAキットを用いて抽出を行った。2.D4,D5,N,M分類mtDNAの5178と10398を標的としてPCR増幅後、制限酵素AluIで消化した。3.N9b及びN9b以外のNの分類mtDNAの13183を標的としてPCR増幅後、制限酵素Tsp45I(MaeIIIと比較)で消化した。4.N9a及びN9a以外のNの分類mtDNAの12358を標的としてPCR増幅後、制限酵素SfcIで消化した。5.M7a及びM7a以外の鼠の分類mtDNAの4958を標的としてPCR増幅後、制限酵素NlaIIIで消化した。【研究成果】1.PCR増幅条件(全方法)変性剤無し、アニーリング温度55℃の条件で、単一バンドかつ高増幅が認められた。2.制限酵素処理(全方法)0.4U(1反応)で完全に消化された。ハプログループN9bの分類では、制限酵素MaeIIIと同等の結果が得られた。3.塩基配列の確認無作為抽出した検体を用いて、塩基醗列を確認したところ、PCR-RFLP法と同等の結果が得られた。4.まとめ方法1から5により、D4,D5,N9a,N9b,N9a/b以外のN,M7a,M7a以外のMの7つのmtDNAハプログループ分類が可能であることがわかった。※1)Tanaka et al.(2004) Genome Res. 14, 1832-1850

[Objective] To investigate the use of mtDNA in the study of genetic diversity and DNA aggregation. 2004 Tanaka^<1)> Japanese, Chinese, Japanese, Japanese, Chinese, Japanese, Japanese The purpose of this study is to investigate the classification of mtDNA, the alignment of mtDNA, and the application of PCR-RFLP. [Method] 1. mtDNA, venous blood, EZNA Blood DNA extraction 2. D4, D5, N, M mtDNA 5178, 10398, PCR amplification, restriction enzyme AluI digestion 3. N9b and N9b are classified into mtDNA 13183, which is amplified by PCR and digested by Tsp45I (MaeIII). 4. The 12358 target of mtDNA other than N9a was amplified by PCR and digested by SfcI. 5. The mtDNA 4958 of mice other than M7a was amplified by PCR and digested by NlaIII. [Results] 1. PCR amplification conditions (all methods) vary from zero to 55℃, and from one to the next. 2. Restriction enzyme digestion (full method)0.4U(1 reverse) is completely digested. The results of the classification and restriction enzyme MaeIII were obtained. 3. The results obtained by PCR and RFLP methods were similar to those obtained by PCR and RFLP methods. 4. Method 1 5, D4,D5,N9a,N9b,N9a/b beyond N,M7a,M7a beyond M 7 mtDNA※1)Tanaka et al. (2004) Genome Res. 14, 1832-1850