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選択的基質を用いたアセチルコリンエステラーゼ測定の臨床応用に関する研究

选择性底物乙酰胆碱酯酶测定的临床应用研究

基本信息

批准号：
24928013
负责人：
白田亨
金额：
$ 0.38万
依托单位：
Yamagata University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Scientists
财政年份：
2012
资助国家：
日本
起止时间：
2012-04-01 至 2013-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-24928013/
关键词：
アセチルコリンエステラーゼ特異的測定全血

项目摘要

【目的】アセチルコリンエステラーゼ(AChE)は、神経伝達物質であるアセチルコリンを分解し神経伝達系を制御する重要な酵素である。今回、選択的基質と自動分析装置を用いた簡便で臨床応用可能な全血中AChE測定法の開発を目的とした。【方法】(測定原理)AChEにより基質MATP+(1,1-Dimethyl-4-acetylthiomethylpiperidinium iodide、同仁化学)はsH基をもつ物質に分解される。これにSCH基の検出試薬であるDTNB (5,5'-Dithiobis (2-nitrobenzoic acid)、同仁化学)を反応させ、生成したチオニトロ安息香酸の吸光度変化を測定する。(試薬調製)0.1%Tween20を含むリン酸緩衝液(0.1M, pH7.4)を用いてMATP+溶液(3.5mM)およびDTNB溶液(0.875mM)を作製する。(試料調製)0.1%TritonX-100を含むリン酸緩衝液(0.1M, pH7.4)を用いて、健常者ボランティアより採血された全血を10倍希釈し溶血試料とする。(測定概要)試料5μLとDTNB溶液80μLを混和し37℃で5分間加温後、MATP+溶液20μL加え、450/700nmで反応速度を測定する。活性値は、L-システイン溶液を反応指示物質とした検量係数より算出する。測定機器は日立社製Labospect 008を使用した。【結果】1)同時再現性(CV)は、溶血試料を10回同時測定した場合0.7%(平均1858U/L)、溶血操作を10回行い測定した場合1.3%(平均1842UIL)と両者とも良好であった。2)直線性は電気ウナギ由来のAChE(シグマ社)を用いて636UILまで確認した。10倍希釈の溶血試料では6360UlLまで測定可能となる。3)健常者25名(男9、女16、平均41.7±11.4歳)の測定結果は1667.6±234.3U/Lであった。4) AchE阻害剤(1,5-bis (4-allyldlmethylammoniumphenyl) pentan-3-one、BW284c51)添加による健常者5名の洗浄赤血球と全血の平均阻害率は、97.3%、96.2%と両者ともほぼ完全に阻害され、本法のAChE特異性を確認した。【まとめ】本法は全血を用いて簡便で特異的にAChEを測定可能な方法であり、一般的な自動分析装置に適用可能であるため今後の臨床応用が期待される。

[Objective] AChE is an important enzyme in the control of neurogenesis. The purpose of developing an assay for AChE in whole blood is to simplify the use of selected matrices and automated analytical devices for clinical use. [Method](Determination principle)AChE DTNB (5,5'-Dithiobis (2-nitrobenzoic acid), homo) is used to determine the absorbance of benzoic acid. 0.1% Tween20 was prepared with MATP+ solution (3.5mM) and DTNB solution (0.875mM) in hydrochloric acid buffer (0.1M, pH 7.4). (Sample preparation) 0.1% Triton X-100 acid buffer solution (0.1M, pH 7.4) was used in the middle and normal blood samples. (Summary of measurement) 5μL of sample and 80μL of DTNB solution were mixed and heated at 37℃ for 5 minutes, 20μL of MATP+ solution was added, and the reaction velocity was measured at 450/700nm. The activity value, L-value and the reaction index coefficient of the solution are calculated. The measuring machine Labospect 008 manufactured by Hitachi is used. [Results] 1) Simultaneous reproducibility (CV) was 0.7%(average 1858U/L) when hemolysis sample was tested in 10 cycles, and 1.3%(average 1842UIL) when hemolysis sample was tested in 10 cycles. 2)The origin of the linear electric field is confirmed by 636UIL. 10 times the amount of hemolysis sample is 6360UlL. 3)25 healthy subjects (9 males, 16 females, mean age 41.7±11.4 years old) were tested and the results were 1667.6± 234.3 U/L. 4)AchE inhibitor (1,5-bis (4-allyldlmethylammoniumphenyl) pentan-3-one, BW284c51) was added to 5 healthy individuals. The average inhibition rate of whole blood of washed erythrocytes was 97.3%, 96.2% and 96.2% respectively. The specificity of AchE was confirmed. This method is simple and specific for whole blood use. It is expected to be used in clinical practice in the future.