選択的基質を用いたアセチルコリンエステラーゼ測定の臨床応用に関する研究

【目的】アセチルコリンエステラーゼ(AChE)は、神経伝達物質であるアセチルコリンを分解し神経伝達系を制御する重要な酵素である。今回、選択的基質と自動分析装置を用いた簡便で臨床応用可能な全血中AChE測定法の開発を目的とした。【方法】(測定原理)AChEにより基質MATP+(1,1-Dimethyl-4-acetylthiomethylpiperidinium iodide、同仁化学)はsH基をもつ物質に分解される。これにSCH基の検出試薬であるDTNB (5,5'-Dithiobis (2-nitrobenzoic acid)、同 仁化学)を反応させ、生成したチオニトロ安息香酸の吸光度変化を測定する。(試薬調製)0.1%Tween20を含むリン酸緩衝液(0.1M, pH7.4)を用いてMATP+溶液(3.5mM)およびDTNB溶液(0.875mM)を作製する。(試料調製)0.1%TritonX-100を含むリン酸緩衝液(0.1M, pH7.4)を用いて、健常者ボランティアより採血された全血を10倍希釈し溶血試料とする。(測定概要)試料5μLとDTNB溶液80μLを混和し37℃で5分間加温後、MATP+溶液20μL加え、450/700nmで反応速度を測定する。活性値は、L-システイン溶液を反応指示物質とした検量係数より算出する。測定機器は日立社製Labospect 008を使用した。【結果】1)同時再現性(CV)は、溶血試料を10回同時測定した場合0.7%(平均1858U/L)、溶血操作を10回行い測定した場合1.3%(平均1842UIL)と両者とも良好であった。2)直線性は電気ウナギ由来のAChE(シグマ社)を用いて636UILまで確認した。10倍希釈の溶血試料では6360UlLまで測定可能となる。3)健常者25名(男9、女16、平均41.7±11.4歳)の測定結果は1667.6±234.3U/Lであった。4) AchE阻害剤(1,5-bis (4-allyldlmethylammoniumphenyl) pentan-3-one、BW284c51)添加による健常者5名の洗浄赤血球と全血の平均阻害率は、97.3%、96.2%と両者ともほぼ完全に阻害され、本法のAChE特異性を確認した。【まとめ】本法は全血を用いて簡便で特異的にAChEを測定可能な方法であり、一般的な自動分析装置に適用可能であるため今後の臨床応用が期待される。

【目的】アセチルコリンエステラーゼ(AChE)は、神経伝達物質であるアセチルコリンを分解し神経伝達系を制御する重要な酵素である。今回、選択的基質と自動分析装置を用いた簡便で臨床応用可能な全血中AChE測定法の開発を目的とした。【方法】(測定原理)AChEにより基質MATP+(1,1-Dimethyl-4-acetylthiomethylpiperidinium iodide、同仁化学)はsH基をもつ物質に分解される。これにSCH基の検出試薬であるDTNB (5,5'-Dithiobis (2-nitrobenzoic acid)、同 仁化学)を反応させ、生成したチオニトロ安息香酸の吸光度変化を測定する。(試薬調製)0.1%Tween20を含むリン酸緩衝液(0.1M, pH7.4)を用いてMATP+溶液(3.5mM)およびDTNB溶液(0.875mM)を作製する。(試料調製)0.1%TritonX-100を含むリン酸緩衝液(0.1M, pH7.4)を用いて、健常者ボランティアより採血された全血を10倍希釈し溶血試料とする。(測定概要)試料5μLとDTNB溶液80μLを混和し37℃で5分間加温後、MATP+溶液20μL加え、450/700nmで反応速度を測定する。活性値は、L-システイン溶液を反応指示物質とした検量係数より算出する。測定機器は日立社製Labospect 008を使用した。【結果】1)同時再現性(CV)は、溶血試料を10回同時測定した場合0.7%(平均1858U/L)、溶血操作を10回行い測定した場合1.3%(平均1842UIL)と両者とも良好であった。2)直線性は電気ウナギ由来のAChE(シグマ社)を用いて636UILまで確認した。10倍希釈の溶血試料では6360UlLまで測定可能となる。3)健常者25名(男9、女16、平均41.7±11.4歳)の測定結果は1667.6±234.3U/Lであった。4) AchE阻害剤(1,5-bis (4-allyldlmethylammoniumphenyl) pentan-3-one、BW284c51)添加による健常者5名の洗浄赤血球と全血の平均阻害率は、97.3%、96.2%と両者ともほぼ完全に阻害され、本法のAChE特異性を確認した。【まとめ】本法は全血を用いて簡便で特異的にAChEを測定可能な方法であり、一般的な自動分析装置に適用可能であるため今後の臨床応用が期待される。