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選択的基質を用いた簡便で特異的なアセチルコリンエステラーゼ測定法の開発

使用选择性底物开发简单且特异的乙酰胆碱酯酶测量方法

基本信息

批准号：
25928015
负责人：
白田亨
金额：
$ 0.26万
依托单位：
Yamagata University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Scientists
财政年份：
2013
资助国家：
日本
起止时间：
2013-04-01 至 2014-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

【目的】アセチルコリンエステラーゼ(AChE)は、神経組織や赤血球に存在し、神経伝達物質であるアセチルコリンを分解し神経伝達系を制御する重要な酵素である。これまで我々は、選択的基質MATP+(同仁化学)を用いて全血中AChE測定法を検討してきた。今回、溶血機能付自動分析装置を用いて溶血操作を含めた完全自動化の簡便で特異的な赤血球AChE測定法を開発することを目的とした。【方法】(測定機器)溶血機能付自動分析装置は日本電子(株)製JCA-BM9130を用いた。(試薬) AChE測定試薬は0.1% Tween 20リン酸緩衝液(0.1M, pH7.4)を用いて基質液(MATP+、3.5mM)および発色液(DTNB、0.875mM)を作製した。ヘモグロビン濃度(Hgb)はヘモグロビンB-テストワコー(和光)を用いて測定した。(試料)健常者ボランティアのヘパリン血を用いた。(測定概要)自動分析装置の溶血機能を用いて遠心血球5μLと前処理液(0.1% Triton X-100リン酸緩衝液)95μLを混和し、溶血試料を作製する。AChEは、溶血試料4.4μLと発色液70μLを混和し37℃5分間加温後、基質液17.5μL加え、451/694nmで反応速度を測定し、活性値(U/L)を算出する。同時に測定した溶血試のHgb値を用いてAChE(U/g Hgb)を計算する。【成績】1) 電気ウナギ由来AChEおよびHgb標準液(ウマ赤血球)を用いて希釈直線性を検討すると、AChEは913 U/L、Hgbは4.6 g/dlまで直線性を確認した。2) 10回測定の同時再現性(CV)を検討すると、AChEは1.2%(平均170.4 U/L)、1.9%(198.3 U/L)、Hgbは1.4%(1.48g/dl)、2.0%(1.47g/dl)であったが、AChE(U/g Hgb)では0.6%(平均11.5)および0.5%(13.5)と1%以下に低下した。3) 常者5例で用手溶血法(全血10倍希釈)と自動溶血法(遠心血球20倍希釈)のAChE(U/g Hgb)を比較すると、それぞれの平均値±SDは、11.9±1.40、12.2±1.11であり、溶血方法による差を認めなかった。さらに、血漿ChEを含む全血と遠心血球での測定値に差を認めないため、本法がAChEに特異的な測定法であることが確認された。【結論】自動分析装置の溶血機能を用いることにより、簡便で再現性の良い赤血球AChE測定が可能であり、今後、有機リン中毒の直接的な暴露指標やアルツハイマー型認知症でのAChE阻害剤による治療効果の判定や予測としての臨床応用が期待される。

[Objective] AChE is an important enzyme that regulates the existence of erythrocytes and the decomposition of neurotransmitter substances in the nervous system. The matrix MATP+(Tongren Chemical) was used to determine AChE in whole blood. The purpose of this automatic hemolysis analyzer is to develop a simple, fully automated and specific hemolysis assay. [Method](Measuring machine) Hemolysis function automatic analyzer JCA-BM9130 manufactured by Nippon Electronics Corporation AChE assay was prepared with 0.1% Tween 20 acid buffer solution (0.1M, pH 7.4) and medium solution (MATP+, 3.5mM) and developer solution (DTNB, 0.875mM). The concentration (Hgb) is determined by the use of the B-state detector. (Sample) Healthy people show signs of failure. (Summary of measurement) Hemolysis function of automatic analyzer was used to mix 5μL of telecentric blood cells with 95μ L of pretreatment solution (0.1% Triton X-100 acid buffer) and prepare hemolysis sample. AChE, hemolysis sample 4.4μL, color solution 70μL, mixed, heated at 37℃ for 5 minutes, matrix solution 17.5μL, reaction rate at 451/694nm, activity value (U/L) were determined. At the same time, AChE(U/g Hgb) is calculated by measuring the Hgb value of the hemolysis test. [Results] 1) The current source is AChE and Hgb standard solution (red blood cells). The linearity of AChE is 913 U/L and Hgb is 4.6 g/dl. 2)The simultaneous reproducibility (CV) of 10-cycle measurement was 1.2%(average 170.4 U/L), 1.9%(198.3 U/L), 1.4%(1.48 g/dl), 2.0%(1.47 g/dl), 0.6%(average 11.5), 0.5%(13.5) and 1% lower than AChE. 3)The AChE(U/g Hgb) of 5 patients with normal hemolysis was compared between manual hemolysis method (whole blood 10 times) and automatic hemolysis method (telecentric blood cells 20 times), and the mean values ±SD, 11.9±1.40 and 12.2±1.11 were compared. This method is specific to the determination of plasma ChE in whole blood. [Conclusion] It is possible to measure AChE in erythrocytes with good reproducibility in the application of automatic analyzer. In the future, it is expected to determine the therapeutic effect of AChE in patients with cognitive disorder by direct exposure index of organic poisoning.