識別困難な同属植物種における高感度ＤＮＡ分析による種同定法の新規開発

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(研究目的)本研究は、1)市販されている数種の植物DNA抽出キットを用いて、より微細な法科学的植物試料からの効率的なDNA抽出法の検討、2)植物種特異的プライマーを用いたリアルタイムPCR法により、これまで識別困難であった同属植物種を、簡便かつ高感度に種レベルで同定する方法を新たに開発し、鑑定実務へ展開させることを目的とする。(研究方法)DNA抽出法の検討については、市販キットである、GM quicker 4(ニッポン・ジーン)、DNeasy Plant minikit(キアゲン)MagExtractor Plant Genome(東洋紡)、Plant DNA Isolation Reagent(TaKaRa)を用いることとした。試料は、識別困難と思われる同属植物のうち、キャベツ、ハクサイ、チンゲンサイ、コマツナ(以上、アブラナ科植物)、タマネギ、ネギ(以上、ネギ科)とし、法科学現場で扱われるごく微細な試料を想定して、2mm角程度の大きさに調製したもの、さらに人工胃液で消化させたものからDNA抽出効率を検討した。また植物種を簡便かつ高感度に同定するためのリアルタイムPCR法について、葉緑体遺伝子間領域trnH-psbAを標的としたPCRを行い、シークエンス解析したのち、同属種を効率的に識別するための一塩基多型(SNPs)を同定し、これを用いた解析を可能とする条件検討を行った。(研究成果)各種市販キットを用いたDNA抽出法については、DNAの回収量、精製度、操作の煩雑さなどの点で、DNeasy Plant mini kit(キアゲン)が最も有用であることが明らかとなった。特に人工消化させた試料では、液体窒素を用いた凍結破砕をせずとも、抽出することができ、胃内容物に見られる超微細試料においてもロスを少なく抽出できるものと考えられた。trnH-psbAを標的としたPCRについては、ネギ科植物ではSNPsを設定することができ、リアルタイムPCRを用いて高感度に種を識別できることが明らかとなった。アブラナ科植物については、既報の文献にあるプライマー配列では、シングルバンドを得ることができなったことから、新たな領域を設計し、継続検討中である。