葉脈走行パターン解析と高感度DNA分析による高度消化食物残渣における植物種の同定

使用叶脉运行模式分析和高灵敏度 DNA 分析鉴定高度消化的食物残渣中的植物种类

• 批准号: 25933005
• 负责人: 櫻田 誠
• 金额: $ 0.38万
• 依托单位: 兵庫県警察科学捜査研究所
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Scientists
• 财政年份: 2013
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2013-04-01 至 2014-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-25933005/
• 关键词: 消化残渣; リアルタイムPCR; 葉脈

殺人事件の被害者から採取される食物消化残渣の検査は、被害者の生前の足取りや死後経過時間を知る上で犯罪捜査上極めて重要な検査の一つである。本研究では、高度に消化されながらも消化管内に残存していることの多い葉菜類について、①顕微鏡を用いた葉脈の走行パターン解析、②trnL-P6loopを標的にしたリアルタイムPCRによる融解曲線分析に着目して、植物種の新たな同定法の開発について検討した。葉脈の走行パターン解析にっいては、葉部の一部から水酸化ナトリウムを用いて葉脈標本を作製し、顕微鏡で詳細に観察することによって行った。葉脈は、太い主脈から側脈へと枝分かれし、さらに細かい葉脈に分岐する。キャベツ、ハクサイを観察した結果では、いずれも双子葉植物であることから葉脈は網状を呈していた。この網状構造は、観察した部位においては、大きさ、形状に違いが認められるものの、その構造はかなり複雑であった。またその最小構造単位は約3×6mm程度であり、葉脈パターンの違いを観察するためには、ある程度の大きさが必要であり、実際の高度消化残渣に応用するには、さらなる検討が必要であると考えられた。trnL-P6loopを標的にしたリアルタイムPCRによる融解曲線分析では、葉菜7種(キャベツ、ハクサイ、コマツナ、キクナ、レタス、タマネギ、ネギ)について検討した。植物試料から市販のキットを用いてDNAを抽出し、PCRに供した。trnL-P6loopを標的としたプライマー配列は、Taberlet等(*)が報告しているものを使用した。リアルタイムPCRの前に、通常のPCRを行い、アガロースゲルで電気泳動して確認した結果、いずれの植物試料で単一バンドによる増幅産物を確認することができた。次に、最適な条件下でリアルタイムPCRを行い、融解曲線分析を行った結果、trnL6-P6を用いた解析では、標的とする領域が小さい分、高度な消化を受けた植物試料でも検出することが可能であった。しかし、同属試料の中には融解温度での識別は困難なものもあり、高感度ではあるが識別力において問題点が残された。消化残渣における植物種同定についは、試料に残存するDNAの質・量を考慮し、その検査法の選択をする必要性があると判断された。(*)Nucleic Acids Research 2007 35 (3)

The investigation of food digestion residue of the victim of the murder incident, the investigation of the victim's life, the investigation of the time after death, and the investigation of the crime are extremely important. In this study, we focused on highly sensitive digestion, microscope-based analysis of vein movement, trnL-P6loop targeting, PCR analysis of melting curves, and development of new methods for identification of plant species. A part of the leaf is acidified by water. The leaf is controlled by a microscope. The main vein is divided into branches, and the branches are divided into branches. The result is dicotyledon. The network structure is divided into two parts: the middle part, the big part, the shape part and the complex part. The minimum structural unit of the plant is about 3×6mm, and the maximum degree of digestion residue is necessary. TrnL-P6loop target PCR analysis of 7 species of leaf vegetables (,,,,) Plant samples are available for DNA extraction and PCR. trnL-P6loop is used in conjunction with Taberlet (*). Before and after PCR, normal PCR was performed, and the results of electroporation were confirmed. The amplified products of the plant samples were confirmed. Under the optimal conditions, the PCR was performed, the melting curve analysis was performed, the trnL6-P6 was analyzed, and the target field was small and highly digested. The identification of melting temperature in the same sample is difficult, and the identification of high sensitivity is difficult. Determination of plant species in digestion residues, quality and quantity of DNA remaining in the sample, and necessity of selection of test methods (*)Nucleic Acids Research 2007 35 (3)