C型肝炎ウイルスのin vivoおよびin vitro複製系の確立

丙型肝炎病毒体内外复制系统的建立

• 批准号: 08770170
• 负责人: 加藤 珠実
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: Nihon University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08770170/
• 关键词: C型肝炎ウイルス(HCV); 5-azacytidine(5-AC); トランスジェニックマウス; メチル化; RT-PCR法

C型肝炎ウイルス(HCV)のin vivo複製系を確立する目的で、日本株HCV-Nの全長遺伝子をアルブミンまたはSR-αプロモーター制御下に導入したトランスジェニックマウスを作製したが、HCV導入遺伝子は高度にメチル化されその発現は認められなかった。そこで、HCVトランスジェニックマウスに脱メチル化剤を投与し、メチル化解除による導入遺伝子発現を試みた。強力な脱メチル化剤である5-azacytiidine(5-AC)を使用し、初回25ug、以後50ugを生後4日目から1週毎に計4回投与した後、肝臓のpolyA^+RNAを精製し、HCV導入遺伝子の発現をノーザンブロット法またはRT-PCR法により解析した。RT-PCR法による解析は、RNA抽出時のDNAの混入を考慮しDNase処理をした後に行った。その結果、5-AC投与によるHCV遺伝子発現誘導は、ノーザンブロット法では検出不能であったが、RT-PCR法では、アルブミンをプロモーターとして使用した2ラインのマウス(FA39,FA44;導入コピー数;2〜5)において確認することができた。また、これらのマウスにおけるHCVの蛋白レベルでの発現を検討するため、ウエスタンブロット法によるHCVコア蛋白の検出を試みたがいずれのラインにおいても認められなかった。HCV導入遺伝子の発現量からも産生されるHCV抗原量は少ない事が予測され、免疫組織学的な検索を含めたより高感度なHCV蛋白検出系での検討が必要であると考えた。現在、5-ACによるmRNAの発現誘導に成功したFA39,44に関して免疫組織学的な検索を進めると共に、in vitro複製系の確立を目指してこれらのマウスの肝細胞培養系を作成中である。

Hepatitis C virus (HCV) in vivo replication system to establish the purpose, the Japanese strain HCV-N full-length gene expression under the control of the introduction of the gene expression, HCV introduced gene expression under the control of the high level of development and recognition. In addition, HCV can also be used to detect and detect the presence of the virus. 5-azacytidine (5-AC) was administered 4 times a week after the initial dose of 25ug and 50ug 4 days after birth. PolyA^+RNA in liver was purified and detected by RT-PCR. RT-PCR analysis, RNA extraction and DNA mixing are considered after DNA processing Results: HCV gene expression was induced by 5-AC, detected by RT-PCR, detected by 2-AC (FA39, FA44), and confirmed by 2-AC (FA39, FA44) The detection of HCV protein is discussed in detail in this paper. HCV introduced protein expression levels decreased, HCV antigen levels decreased, and it was necessary to investigate the presence of HCV protein in immunohistologic assays, including high sensitivity HCV protein assays. Now, successful induction of 5-AC mRNA expression, FA39,44, progress of immunohistologic assay, establishment of in vitro replication system, and establishment of hepatocyte culture system are under way.

项目成果

Kato,T.et al.: "Inactivation of hepatitis C virus cDNA transgene by hypermethylation in transgenic mice." Archives of Virology. 141,5. 951-958 (1996)

Kato,T.et al.：“转基因小鼠中丙型肝炎病毒 cDNA 转基因通过高甲基化失活。”