C型肝炎ウイルスのin vivoおよびin vitro複製系の確立

C型肝炎ウイルス(HCV)のin vivo複製系を確立する目的で、日本株HCV-Nの全長遺伝子をアルブミンまたはSR-αプロモーター制御下に導入したトランスジェニックマウスを作製したが、HCV導入遺伝子は高度にメチル化されその発現は認められなかった。そこで、HCVトランスジェニックマウスに脱メチル化剤を投与し、メチル化解除による導入遺伝子発現を試みた。強力な脱メチル化剤である5-azacytiidine(5-AC)を使用し、初回25ug、以後50ugを生後4日目から1週毎に計4回投与した後、肝臓のpolyA^+RNAを精製し、HCV導入遺伝子の発現をノーザンブロット法またはRT-PCR法により解析した。RT-PCR法による解析は、RNA抽出時のDNAの混入を考慮しDNase処理をした後に行った。その結果、5-AC投与によるHCV遺伝子発現誘導は、ノーザンブロット法では検出不能であったが、RT-PCR法では、アルブミンをプロモーターとして使用した2ラインのマウス(FA39,FA44;導入コピー数;2〜5)において確認することができた。また、これらのマウスにおけるHCVの蛋白レベルでの発現を検討するため、ウエスタンブロット法によるHCVコア蛋白の検出を試みたがいずれのラインにおいても認められなかった。HCV導入遺伝子の発現量からも産生されるHCV抗原量は少ない事が予測され、免疫組織学的な検索を含めたより高感度なHCV蛋白検出系での検討が必要であると考えた。現在、5-ACによるmRNAの発現誘導に成功したFA39,44に関して免疫組織学的な検索を進めると共に、in vitro複製系の確立を目指してこれらのマウスの肝細胞培養系を作成中である。

C型肝炎ウイルス(HCV)のin vivo複製系を確立する目的で、日本株HCV-Nの全長遺伝子をアルブミンまたはSR-αプロモーター制御下に導入したトランスジェニックマウスを作製したが、HCV導入遺伝子は高度にメチル化されその発現は認められなかった。そこで、HCVトランスジェニックマウスに脱メチル化剤を投与し、メチル化解除による導入遺伝子発現を試みた。強力な脱メチル化剤である5-azacytiidine(5-AC)を使用し、初回25ug、以後50ugを生後4日目から1週毎に計4回投与した後、肝臓のpolyA^+RNAを精製し、HCV導入遺伝子の発現をノーザンブロット法またはRT-PCR法により解析した。RT-PCR法による解析は、RNA抽出時のDNAの混入を考慮しDNase処理をした後に行った。その結果、5-AC投与によるHCV遺伝子発現誘導は、ノーザンブロット法では検出不能であったが、RT-PCR法では、アルブミンをプロモーターとして使用した2ラインのマウス(FA39,FA44;導入コピー数;2〜5)において確認することができた。また、これらのマウスにおけるHCVの蛋白レベルでの発現を検討するため、ウエスタンブロット法によるHCVコア蛋白の検出を試みたがいずれのラインにおいても認められなかった。HCV導入遺伝子の発現量からも産生されるHCV抗原量は少ない事が予測され、免疫組織学的な検索を含めたより高感度なHCV蛋白検出系での検討が必要であると考えた。現在、5-ACによるmRNAの発現誘導に成功したFA39,44に関して免疫組織学的な検索を進めると共に、in vitro複製系の確立を目指してこれらのマウスの肝細胞培養系を作成中である。