Bordetella壊死毒の機能ドメインの解析

Bordetella bronchiseptica壊死毒(DNT)に対するモノクローナル抗体11クローンを作製した。そのうちDNT活性中和能をもつ2B3抗体と、中和能を持たない1A3抗体が認識する抗原決定基のDNT上の領域を以下のように調べた。DNT(分子量150,000)をトリプシンで処理し、分子量約90,000と約60,000のそれぞれC末端側とN末端側に位置する主要な二つの毒素フラグメント(90k frag.と60k frag.)を得た。また、DNT遺伝子の制限酵素認識部位を利用し8種類の部位欠失DNT変異体を作製した。毒素フラグメントと部位欠失DNT変異体を電気泳動し、上述の2種の抗体を用いてイムノブロッティングを行い、それぞれの抗体が反応するかどうかを調べた。その結果、両抗体はN末端側から889残基のアミノ酸で構成される変異体に反応した。2B3抗体は270残基目から1,059残基目までを欠失した変異体に反応したが、48残基目から474残基目を欠失した変異体と45残基目から約500残基目までで構成される60k frag.には反応しなかった。一方、1A3抗体は60k frag.には反応したが、284残基目から550残基目までのアミノ酸を欠失した変異体には反応しなかった。これらの結果を総合したところ、抗DNTモノクローナル抗体の反応1A3と2B3が認識する抗原決定基は各々、DNTのN末端側より284-474アミノ酸残基の位置と、45-48アミノ酸残基の近傍に局在する事が明らかとなった。現在、DNTの機能的ドメインの構造についてさらに解析を進めている。

Bordetella bronchiseptica壊死毒(DNT)に対するモノクローナル抗体11クローンを作製した。そのうちDNT活性中和能をもつ2B3抗体と、中和能を持たない1A3抗体が認識する抗原決定基のDNT上の領域を以下のように調べた。DNT(分子量150,000)をトリプシンで処理し、分子量約90,000と約60,000のそれぞれC末端側とN末端側に位置する主要な二つの毒素フラグメント(90k frag.と60k frag.)を得た。また、DNT遺伝子の制限酵素認識部位を利用し8種類の部位欠失DNT変異体を作製した。毒素フラグメントと部位欠失DNT変異体を電気泳動し、上述の2種の抗体を用いてイムノブロッティングを行い、それぞれの抗体が反応するかどうかを調べた。その結果、両抗体はN末端側から889残基のアミノ酸で構成される変異体に反応した。2B3抗体は270残基目から1,059残基目までを欠失した変異体に反応したが、48残基目から474残基目を欠失した変異体と45残基目から約500残基目までで構成される60k frag.には反応しなかった。一方、1A3抗体は60k frag.には反応したが、284残基目から550残基目までのアミノ酸を欠失した変異体には反応しなかった。これらの結果を総合したところ、抗DNTモノクローナル抗体の反応1A3と2B3が認識する抗原決定基は各々、DNTのN末端側より284-474アミノ酸残基の位置と、45-48アミノ酸残基の近傍に局在する事が明らかとなった。現在、DNTの機能的ドメインの構造についてさらに解析を進めている。