百日咳菌の特異的なヒト感染性を規定する因子の検索

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Bordetella属細菌を用いて、in vivo expression technology (IVET)を導入することが本研究課題の当初の目的である。そこで、細菌感染時に転写活性の上昇するプロモーターをクローニングするために遺伝子組み換え誘発タンパクCreの上流に気管支敗血症菌(Bordetella bronchiseptia)の染色体DNA断片を挿入したライブラリーを作製し、一方でCreの標的配列であるloxPに挟まれたレポーター遺伝子を含むターゲティングベクターを作製することを試みた。しかし、大腸菌を使用して構築したプラスミドベクターをBordetella属細菌に導入する際の効率がきわめて悪いことがわかった。そこで、電気穿孔法と接合法の二つの方法を用いて、Bordetella属細菌が持つDNT遺伝子を相同組換えによって欠失させることをモデル実験として、Bordetella属細菌へのプラスミドベクターの導入方法をあらためて検討した。その結果、電気穿孔法よりも接合法が遺伝子導入の効率がはるかに高いことがわかった。また、大腸菌に比べてBordetella属細菌の増殖速度はきわめて遅いため、あらかじめ対数増殖期に調製したBordetella属細菌を接合に用いるのがもっとも効率のよい遺伝子導入方法であることがわかった。このような予備実験の結果、ようやく、Bordetella属細菌への遺伝子導入の基礎条件が判明し、実際に相同組換えによるDNT遺伝子の欠失変異体の百日咳菌(Bordetella pertussis)を作製することが出来た。この結果を基礎に、将来的にIVET法をBordetella属細菌に応用する予定である。