Bordetella壊死毒の分子レベルの作用機構の解析

坏死博德特氏菌毒素的分子水平作用机制分析

基本信息

  • 批准号:
    07770194
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 0.7万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    日本
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
  • 财政年份:
    1995
  • 资助国家:
    日本
  • 起止时间:
    1995 至 无数据
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

Bordetella bronchiseptica壊死毒(DNT)の二種のトリプシン消化断片(60kDaおよび90kDa)のN末端側アミノ酸配列を自動アミノ酸シークエンサーで決定し、得られたアミノ酸配列に基づいてプローブを合成した。このプローブで、種々の制限酵素で消化したB.bronchisepticaの染色体DNAをサザーンブロットし、陽性反応の得られたBamHI,Apal,BamHi-Apal消化DNA断片を用いて部分ライブラリーを作製した。このライブラリーを前記の合成DNAプローブを用いてスクリーニングを行い壊死毒遺伝子をクローニングし、さらにその塩基配列を決定した。クローン化したDNT遺伝子を定法に従ってpET21発現ベクターに組み込み(pETDNTwt)、E.coli BL21(DE3)株に導入してE.coliのDNT発現系を作製した。pETDNTwtを導入したE.coliの菌体抽出液からは抗DNT IgGで中和される皮膚壊死活性が検出できた。B.bronchiseptica DNTをコードするDNAの塩基配列からDNTの全アミノ酸配列を推定したところ、DNTは1,464アミノ酸残基からなり、その分子量は160,602であることがわかった。既に報告されたB.pertussisのDNTとアミノ酸配列を比較したところ、両者には97.95%の相同性が認められた。アミノ酸配列のモチーフ検索をしたところ、B.pertussis DNTと同様にB.bronchiseptica DNTにおいてもC末端側にP-loopと呼ばれるATP/GTP結合モチーフが存在することがわかった。またDNTと同じく、Rhoを標的分子にもつ大腸菌のCNF2ともC末端側において35%程度類似性のあることが確認できた。以上の結果からDNT分子のC末端側に活性ドメイン、すなわちRhoと反応する部位が存在する事が考えられる。
Bordetella bronchiseptica 壊 death poison (DNT) two の の ト リ プ シ ン digestion fragment (60 kda お よ び 90 kda) の N terminal side ア ミ ノ acid with column を automatic ア ミ ノ acid シ ー ク エ ン サ ー で decided し, ら れ た ア ミ ノ acid with column に base づ い て プ ロ ー ブ を synthetic し た. こ の プ ロ ー ブ で, kind of 々 で limitations の enzyme digestion し た B.b ronchiseptica の chromosome DNA を サ ザ ー ン ブ ロ ッ ト し, positive 応 の have ら れ た BamHI, Apal, BamHI - Apal digested DNA fragment を with い て part ラ イ ブ ラ リ ー を cropping し た. こ の ラ イ ブ ラ リ ー を before remember の synthetic DNA プ ロ ー ブ を with い て ス ク リ ー ニ ン グ を line い 壊 dead traces of poison 伝 son を ク ロ ー ニ ン グ し, さ ら に そ の salt base with column を decided し た. ク ロ ー ン change し た DNT posthumous son 伝 を optional に 従 っ て pET21 発 now ベ ク タ ー に group み 込 み (pETDNTwt), e.c. with our fabrication: oli BL21 (DE3) strains に import し て e.c. with our fabrication: oli の DNT 発 を makes make し た. PETDNTwt を import し た e.c. with our fabrication: oli の bacteria extract か ら は で DNT IgG and resistance さ れ る 壊 dead skin active が 検 out で き た. B.b ronchiseptica DNT を コ ー ド す る DNA の salt base with column か ら DNT の full ア ミ ノ acid with column を presumption し た と こ ろ, DNT は 1464 ア ミ ノ acid residues か ら な り, そ の は molecular weight 160602 で あ る こ と が わ か っ た. Both に report さ れ た p. ertussis の DNT と ア ミ ノ acid with column を compare し た と こ ろ, struck に は 97.95% gay が の phase recognition め ら れ た. ア ミ ノ acid with column の モ チ ー フ 検 cable を し た と こ ろ, p. ertussis DNT と with others に B.b ronchiseptica DNT に お い て も C terminal side に P - loop と shout ば れ る ATP/GTP combination made モ チ ー フ が exist す る こ と が わ か っ た. ま た DNT と with じ く, Rho を target molecules に も つ coliform の CNF2 と も C terminal side に お い て 35% degree of similarity の あ る こ と が confirm で き た. の above results か ら DNT molecular の C terminal side に active ド メ イ ン, す な わ ち Rho と anti 応 す が る parts exist す る matter が exam え ら れ る.

项目成果

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