メチル馬尿酸に対する酵素免疫測定法の確立

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キシレンによる傷害からの作業者の保護のため、生物学的モニタリングとして、その代謝物である尿中のメチル馬尿酸(MHAs)の測定が行われている。本研究では、多検体測定の所要時間短縮と操作の簡便化の目的で、MHAsに対するモノクローナル抗体の作成とそれを用いた酵素免疫測定法の確立を試みた。MHAsの免疫については、我々が先に、馬尿酸(HA)に対する抗体を得た時と同様、MHAsのグリシンをリジンに置換したものをハプテンとして行なった。ただし、HAの場合には、L-リジンを用いたが、今回は、通常生体には利用されていないD-リジンを用いた。即ち、3種類のMHA異性体(o-、m-、p-MHA)に相当するN-α-o-トルオイル-D-リジン、N-α-m-トルオイル-D-リジン、N-α-p-トルオイル-D-リジンをハプテンとし、カサ貝ヘモシアニンにグルタルアルデヒドを用いて結合させ、各々BALB/cマウスに免疫した。モノクローナル抗体の作成には、SP2/0マウスミエローマ細胞とポリエチレングリコールを用い、増殖してきたハイブリドーマは、各培養上清中の抗体のハプテンに対する反応性を元に選択した。その際、カルボジイミドを架橋剤として、免疫原の調製時とは異なった方法で各ハプテンをELISAプレートに共有結合させたものを用いた。これにより、抗キャリア抗体とハプテン-キャリア結合部に対する抗体による妨害を除くことができた。各抗原に対し、各々複数のクローンを得ることができたが、同一抗原に対するものはお互いに性質が似ていた。MHA異性体同士の交差反応性は、概ね満足できるものであったが、HAに対する交差反応性が比較的高く、尿の様にHAの濃度がMHAsに比べて非常に高い場合、特異的なELISA法を確立するのが困難であった。今後は、抗体の取り直し、ELISA系の改良の2点について検討を続けたいと考えている。