Multiple Sulfatase Deficiencyの分子生物学的病因解明

多种硫酸酯酶缺乏症的分子生物学发病机制

• 批准号: 08770584
• 负责人: 黒澤 健司
• 金额: $ 0.7万
• 依托单位: Jikei University School of Medicine
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08770584/
• 关键词: アリルスルファターゼA; GST融合蛋白質; Multiple sulfatase deficiency (MSD); 線維芽細胞; SDS-PAGE

平成8年度はアリルスルファターゼAのアミノ酸構造の内、翻訳後修飾として2-アミノ-3プロピオン酸に置換されているアミノ酸配列69番目のシステイン残基、およびその近傍と結合反応する物質をSDS-PAGEで確認した。はじめに、ヒト線維芽細胞から抽出したRNAより逆転写反応によってアミノ酸コード領域全体を含むアリルスルファターゼAのcDNAを作成し、融合蛋白質が正しく発現されるように読み取り枠をあわせ、GSTの発現ベクターであるpGEX-2Tに組み込み、サブクローニングした。融合蛋白質を大腸菌で大量に産生させて、グルタチオンビーズで融合蛋白質を回収精製した。同様の過程でアリルスルファターゼB、CそれぞれについてもGSTとの融合蛋白質を大量に生成し、グルタチオンビーズ上に回収精製した。それぞれについて、約10から15mgを回収しえた。これらに対して^<35>S-メチオニンでメタボリックに標識した正常線維芽細胞抽出液、およびMSD患者線維芽細胞抽出液を加え、4℃30分間回転し、その後遠心してグルタチオンビーズを回収した。上清を除き、結合バッファーを加え、SDS-PAGEにて解析した。さらに、アリルスルファターゼAの69番目のシステイン残基の近傍にあり、他のスルファターゼと相同性の高いプロリン、セリン、アルギニンの欠失させた変異型のGST融合蛋白質を作成し、^<35>S-メチオニンで標識した正常線維芽細胞抽出液を反応させ、回収し、SDS-PAGEで解析した。正常GST融合蛋白質と変異融合蛋白質の泳動の違いは融合蛋白質の違いのみならず、この領域に反応する未知の因子の有無として検出されるはずである。しかし、ASA、ASBでこのパターンは微妙にことなり、この違いを現在検討中である。またこの差が正常細胞、Multiple sulfatase deficiency(MSD)細胞各々の抽出液との反応における違いとして検出されたバンドに相当するものかも、現在検討中である。

In 2008, SDS-PAGE was performed to confirm the internal and post-translational modifications of the structure of the amino acid sequence, the substitution of the amino acid sequence, and the near-binding amino acid sequence of the amino acid sequence. The cDNA of pGEX-2T was prepared from the cDNA of pGEX-2T, which was extracted from pGEX-2T cells, and the cDNA of pGEX-2T was prepared from pGEX-2T cells. Fusion protein is produced in large quantities by Escherichia coli, and fusion protein is purified. In the same process, GST fusion protein is produced in large quantities and refined in large quantities. It's about 10 to 15 mg. The <35>temperature of normal line cell extract, MSD patient line cell extract, 4℃30 minutes, and post-telecentric line cell extract were measured. The supernatant was removed, and the protein was analyzed by SDS-PAGE. The GST fusion protein was prepared, identified, and analyzed by SDS-PAGE for the 69-point <35>sequence of protein residues in the vicinity of the protein, and its similarity to the protein. Normal GST fusion protein and hetero-fusion protein migration in the fusion protein in the presence of unknown factors in the domain of the reaction Asa, ASB, etc. The difference between normal cells, Multiple sulfatase deficiency(MSD) cells and extracts from different cells was detected.

项目成果

Kurosawa K,et al.: "Self-inducedvomiting in X-linked α-thalassemia/mental・・・" AmJ Med Genet. 63. 505-506 (1996)

Kurosawa K 等人：“X 连锁 α 地中海贫血/精神疾病中的自我诱导呕吐……”AmJ Med Genet 63. 505-506 (1996)

Masuno M,Kurosawa K,et al.: "Osteodysplastic primodial dwarfism : a case with feature of・・・" Clin Dysmorphol. 4. 57-62 (1995)

Masuno M、Kurosawa K 等人：“骨发育不良的原始侏儒症：具有......特征的病例”Clin Dysmorphol。

Masuno M,Kurosawa K,et al.: "Submicroscopic deletion of chromosome region 16p13.3・・・" Am J Med Genet. 53. 352-354 (1995)

Masuno M、Kurosawa K 等人：“染色体区域 16p13.3 的亚显微缺失...”Am J Med Genet。53. 352-354 (1995)