TIMP-2遺伝子導入後の腫瘍増殖能抑制に関与する遺伝子の検索

ヒトグリオーマの外科摘出標本でのTIMP-2のNorthern blottingで、alternative splicingの可能性を示唆する複数のmRNAが認められた。ヒトグリオーマ組織由来RNAから作成したcDNAを対象としたPCR法によって、TIMP-2遺伝子DNA配列を増幅したところ、使用したプライマーの位置から予想されるTIMP-2由来産物のサイズよりも小さいPCR産物の存在を認めた。その塩基配列は、TIMP-2遺伝子DNA塩基配列と比べてExon1の3'末端で266bpが存在しない配列であった。このalternative splicingによるTIMP-2cDNAを発現ベクターpRC/CMVに組み込み、ヒトグリオーマ細胞株U-87MGに導入、ネオマイシンアナログであるG418に耐性のクローンから同遺伝子を発現するものを選別した。これと、コントロールのベクター群との間で細胞増殖能を比較したところ、顕著な抑制を示すクローンを確認した。TIMP-2に対するポリクローナル抗体を用いたWestern blotting法および免疫沈降によって、Alternative splicingにより生じた核酸の配列で検索したopen reading frameより予想されるアミノ酸残基配列に相当するタンパクを捉えることはできなかった。従って、この遺伝子を導入したことにより、腫瘍増殖能に関与する遺伝子の発現に影響を及ぼしている可能性が高いと考えられた。増殖能抑制が生じたグルオ-マ細胞の遺伝子発現の変化を検索しグリオーマの増殖能に関与する遺伝子を同定するため、コントロールベクター導入細胞、遺伝子低発現細胞および高発現細胞を用いたdifferencial displayを行い、現在、増殖能に関与すると予想されるDNA断片の塩基配列決定を施行している。

ヒトグリオーマの外科摘出標本でのTIMP-2のNorthern blottingで、alternative splicingの可能性を示唆する複数のmRNAが認められた。ヒトグリオーマ組織由来RNAから作成したcDNAを対象としたPCR法によって、TIMP-2遺伝子DNA配列を増幅したところ、使用したプライマーの位置から予想されるTIMP-2由来産物のサイズよりも小さいPCR産物の存在を認めた。その塩基配列は、TIMP-2遺伝子DNA塩基配列と比べてExon1の3'末端で266bpが存在しない配列であった。このalternative splicingによるTIMP-2cDNAを発現ベクターpRC/CMVに組み込み、ヒトグリオーマ細胞株U-87MGに導入、ネオマイシンアナログであるG418に耐性のクローンから同遺伝子を発現するものを選別した。これと、コントロールのベクター群との間で細胞増殖能を比較したところ、顕著な抑制を示すクローンを確認した。TIMP-2に対するポリクローナル抗体を用いたWestern blotting法および免疫沈降によって、Alternative splicingにより生じた核酸の配列で検索したopen reading frameより予想されるアミノ酸残基配列に相当するタンパクを捉えることはできなかった。従って、この遺伝子を導入したことにより、腫瘍増殖能に関与する遺伝子の発現に影響を及ぼしている可能性が高いと考えられた。増殖能抑制が生じたグルオ-マ細胞の遺伝子発現の変化を検索しグリオーマの増殖能に関与する遺伝子を同定するため、コントロールベクター導入細胞、遺伝子低発現細胞および高発現細胞を用いたdifferencial displayを行い、現在、増殖能に関与すると予想されるDNA断片の塩基配列決定を施行している。