ポルフィロモナス・ジンジバリスによる細胞死のメカニズムの解析

牙龈卟啉单胞菌引起细胞死亡的机制分析

• 批准号: 08771957
• 负责人: 吉岡 昌美
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: The University of Tokushima
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08771957/
• 关键词: ポルフィロモイス・ジンジバリス; 細胞死; ヒト歯肉線維系細胞

本研究では、(1)膜障害により逸脱するLDHの活性を測定する方法(LDH assay)(2)ミドコンドリアの酸素活性をWST-1を用いて測定する方法(WST-1法)により、ヒト歯肉線維芽細胞(HGF)に対するP.gingivalisの細胞毒性について検索した。まず、P.gingivalisの外膜、外膜小胞及びLPSをHGFに作用させ24時間反応させた後HGFを溶解し、溶解液のLDH活性を測定した(LDH assay)。その結果、外膜、LPSではHGFのLDH活性に変化は認められず、外膜小胞を添加したHGFでLDH活性の低下が認められた。また、この作用は外膜小胞を100℃にて15分間加熱処理することにより失われた。次に、外膜小胞の濃度を0、12.5、50、100μg/mlに調整してHGFに作用させ、22時間インキュベートした後培養液にWST-1溶液を添加し、HGFのミトコンドリアに存在する脱水素酵素の活性を測定した(WST-1法)。その結果、各濃度での活性はコントロールに比べて各々、98.4、89.2、69.4、57.8%と濃度依存的に活性が低下していることが分かった。同時に調べたLDH活性は104、98.1、82.7、83.6%とこれも濃度が上がるに従って低下する傾向が認められた。P.gingivalisの外膜小胞がHGFに対してアポトーシスを引き起こすのかどうかを、DNAフラグメンテーション検出キットを用いて調べた。その結果、外膜小胞濃度12.5、25、50、100μg/mlを添加したHGFのDNA断片量(OD_<450>)は、コントロールに比べて各々、1.5、1.9、4.8、6.8倍と濃度依存的に増加していた。また、加熱処理した外膜小胞を添加した場合にはこのような作用は認められなかった。外膜小胞によるHGFのDNAフラグメンテーションの時間経過を調べたところ、30分後にすでに22時間後に検出されるレベルまで達していることが分かった。今後は、このようなDNAフラグメンテーションがどの様な経路を経て起こっているものかを他の細胞系で明らかになっているいくつかのアポトーシス抑制物質を用いて検索していく予定である。

This study included: (1) a method for measuring LDH activity in membrane barrier cells (LDH assay);(2) a method for measuring LDH activity in cell membrane barrier cells (WST-1 assay); and (3) a method for detecting cytotoxicity of P. gingivalis to P. gingivalis. The outer membrane, outer membrane vesicles and LPS of P. gingivalis were treated with HGF for 24 hours, and the LDH activity of HGF solution was measured. As a result, the outer membrane, LPS and LDH activity decreased. The outer membrane cells were heated at 100℃ for 15 minutes. Next, the concentration of adventitial vesicles was adjusted to 0, 12.5, 50, and 100μg/ml to allow HGF to act. After 22 minutes, WST-1 solution was added to the culture medium, and the activity of dehydratase in the presence of HGF was measured (WST-1 method). As a result, the activity of each concentration was lower than that of each concentration, 98.4%, 89.2%, 69.4%, 57.8% and concentration dependent activity was lower. At the same time, the LDH activity was 104, 98.1, 82.7 and 83.6% respectively. The outer membrane cells of P. genivalis are regulated by HGF. As a result, the concentration of HGF in outer membrane cells increased by 12.5, 25, 50, 100μg/ml, respectively<450>, 1.5, 1.9, 4.8, and 6.8 fold in concentration-dependent manner. When the outer membrane cells are added to the heat treatment, the effect of heat treatment on the outer membrane cells is recognized. The DNA sequence of HGF in the outer membrane cell was adjusted after 30 minutes, and the DNA sequence was adjusted after 22 minutes. In the future, the DNA sequence will be changed from one cell line to another cell line, and the inhibitory substance will be used in the predetermined way.