ポルフィロモナス・ジンジバリスによる細胞死のメカニズムの解析

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本研究では、(1)膜障害により逸脱するLDHの活性を測定する方法(LDH assay)(2)ミドコンドリアの酸素活性をWST-1を用いて測定する方法(WST-1法)により、ヒト歯肉線維芽細胞(HGF)に対するP.gingivalisの細胞毒性について検索した。まず、P.gingivalisの外膜、外膜小胞及びLPSをHGFに作用させ24時間反応させた後HGFを溶解し、溶解液のLDH活性を測定した(LDH assay)。その結果、外膜、LPSではHGFのLDH活性に変化は認められず、外膜小胞を添加したHGFでLDH活性の低下が認められた。また、この作用は外膜小胞を100℃にて15分間加熱処理することにより失われた。次に、外膜小胞の濃度を0、12.5、50、100μg/mlに調整してHGFに作用させ、22時間インキュベートした後培養液にWST-1溶液を添加し、HGFのミトコンドリアに存在する脱水素酵素の活性を測定した(WST-1法)。その結果、各濃度での活性はコントロールに比べて各々、98.4、89.2、69.4、57.8%と濃度依存的に活性が低下していることが分かった。同時に調べたLDH活性は104、98.1、82.7、83.6%とこれも濃度が上がるに従って低下する傾向が認められた。P.gingivalisの外膜小胞がHGFに対してアポトーシスを引き起こすのかどうかを、DNAフラグメンテーション検出キットを用いて調べた。その結果、外膜小胞濃度12.5、25、50、100μg/mlを添加したHGFのDNA断片量(OD_<450>)は、コントロールに比べて各々、1.5、1.9、4.8、6.8倍と濃度依存的に増加していた。また、加熱処理した外膜小胞を添加した場合にはこのような作用は認められなかった。外膜小胞によるHGFのDNAフラグメンテーションの時間経過を調べたところ、30分後にすでに22時間後に検出されるレベルまで達していることが分かった。今後は、このようなDNAフラグメンテーションがどの様な経路を経て起こっているものかを他の細胞系で明らかになっているいくつかのアポトーシス抑制物質を用いて検索していく予定である。