OxyR蛋白による酸化ストレスの感知とシグナル伝達の分子機構

OxyR蛋白氧化应激传感和信号转导的分子机制

基本信息

批准号：
08780506
负责人：
垰和之
金额：
$ 0.64万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08780506/
关键词：
酸化ストレス転写調節分子生物学

项目摘要

大腸菌OxyR蛋白は、細胞内の酸化ストレスを感知して、支配下遺伝子の調節領域に結合して転写を活性化する蛋白である。この研究では、OxyRの持つストレスセンサー、特異的DNA結合、RNAポリメラーゼとの相互作用などの諸機能が蛋白内のどの部分によって担われているのかを分子遺伝学的手法により明かにすることにより、ストレスの感知から遺伝子発現の活性化に至るまでのシグナル伝達の分子機構を明らかにすることを目的として実験を行い、以下の結果を得た。1)PCR増幅の誤塩基挿入反応を利用して、oxyR遺伝子のコード領域に平均1個のランダムな突然変異を導入した変異oxyR遺伝子ライブラリーを作成し、このライブラリーからDNA結合能、支配下遺伝子の活性化能、酸化ストレスセンサー機能に欠陥を持つ変異oxyR遺伝子を選択した。2)変異oxyR遺伝子の塩基配列の決定を行い変異の位置を同定を行った。その結果、DNA結合能は持つが、転写活性化能を欠く変異は、oxyR遺伝子内の3カ所に集中していることが分かった。3)変異oxyR遺伝子を強力なプロモーター下に連結して、変異OxyR蛋白を増産する大腸菌株を作成した。この大腸菌株の粗抽出液を用いた実験の結果、変異蛋白の多くのものは、OxyR多量体形成、または、DNAベンディングに異常を持つことが明らかとなった。4)数個の変異体は、調べた限りでは野生株と異なる性質は示さなかった。これらの変異体はRNAポリメラーゼとの相互作用に異常を持つものと考えられる。

大肠杆菌氧蛋白是一种蛋白质，可在细胞内感受氧化应激，并与受控基因的调节区域结合以激活转录。在这项研究中，我们进行了一个实验，目的是通过揭示Oxyr的各种功能，例如应力传感器，特定的DNA结合以及与RNA聚合酶的相互作用，以阐明从应力传感到基因表达的激活的信号转导的分子机制，并使用分子遗传技术。 1）在PCR扩增中使用错误的碱基插入反应，创建了一个突变的Oxyr基因文库，其中将一个随机突变的平均值引入到Oxyr基因的编码区域中，并在DNA结合能力中具有缺陷，对受控基因的激活能力，并从该文库中选择了具有缺陷的突变Oxyr基因。 2）确定突变体氧基因的碱基序列，并鉴定出突变的位置。结果表明，具有DNA结合能力但缺乏转录激活能力的突变集中在Oxyr基因内的三个位置。 3）在强启动子下将突变体氧基因连接起来，以产生大肠杆菌菌株，从而增加突变的氧蛋白。使用该大肠杆菌菌株的粗提取物的实验表明，许多突变蛋白在Oxyr多聚合物形成或DNA弯曲方面具有异常。 4）据我们研究，几个突变体没有与野生菌株具有不同的特性。这些突变体被认为与RNA聚合酶具有异常相互作用。