蛋白質燐酸化酵素PKNと相互作用する蛋白因子の同定

与蛋白磷酸化酶 PKN 相互作用的蛋白因子的鉴定

• 批准号: 08780561
• 负责人: 向井 秀幸
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: Kobe University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08780561/
• 关键词: PKN; two-hybrid system; actinin

PKNのアミノ末端をプローブとし、酵母two-hybrid法をもちいて、ヒト脳cDNAライブラリーをスクリーニングした結果、PKNと特異的に相互作用すると考えられる16種類のクローンを得た。そのうちの1種類はアミノ末端のactin結合領域を欠失したα-actininをコードしていた。まず初めに、α-actininとPKNとの相互作用に必要な領域を明らかにするため、それぞれの欠失変異体を用いたin vitro結合実験を行った。その結果、α-actininはPKNのアミノ末端領域と直接結合し、またその結合にはPKNのRhoA結合領域は不要であることがわかった。また、PKNは骨格筋型・非骨格筋型のα-actininの第三番目のspectrin-like repeatと結合し、さらに非骨格筋型のα-actininのEF-hand様領域とカルシウムイオン依存的にそして骨格筋型の同領域とはカルシウム非依存的に結合した。PKNとアミノ末端領域が欠失したタグ付きの変異体α-actininをCOS7細胞に共発現させ、その細胞抽出液よりタグに対する特異抗体をもちいて免疫沈降を行ったところ、この変異体α-actininとともにPKNが共沈することが明らかとなり、細胞内においてもPKNとα-actininが相互作用する可能性が示唆された。ウサギの網状赤血球抽出液を用いたin vitro翻訳系を利用して作製したactin結合領域を含む全長のα-actininは、in vitroにおいてPKNと弱い結合しか示さなかったが、アクチン細胞骨格系の調節に重要な働きをしているとされているphosphatidylinositol 4,5 bisphosphateを添加することにより、その結合活性は上昇した。これらのことから、PKNはα-actininと結合し、細胞骨格系に何らかの影響を与えている可能性が示唆される。

PKN terminal protein expression, yeast two-hybrid method, and PKN specific interaction were investigated. The first kind of actin binding domain is missing. The interaction between α-actin and PKN is necessary for the development of new technologies. As a result, α-actin binds directly to the terminal domain of PKN and binds to the RhoA domain of PKN. PKN is composed of spectrin-like repeat of α-actin and non-lattice-like repeat of α-actin, and combination of α-actin and non-lattice-like repeat of α-actin in EF-hand domain. PKN terminal domain is missing, and different α-actinins are co-produced in COS 7 cells, and cell extracts are used to detect specific antibodies to PKN. In vitro, the binding activity of actin in reticulocyte extract was increased due to the addition of phosphotidylinositol 4,5 bisphosphate. PKN α-actinin binding, cell skeleton, and the possibility of its influence.

项目成果

Watanabe,G.: "Protein kinase N(PKN)and PKN-related protein Phophilin as targets of small GTPase Rho." Science. 271. 645-648 (1996)

Watanabe,G.：“蛋白激酶 N (PKN) 和 PKN 相关蛋白 Phophilin 作为小 GTPase Rho 的靶标。”

Mukai,H.: "PKN associates and phosphorylates the head-rod domaine of neurofilament protein" J.Biol.Chem.271. 9816-9822 (1996)

Mukai,H.：“PKN 关联并磷酸化神经丝蛋白的头杆结构域”J.Biol.Chem.271。

Shibata,H.: "Characterization of the interaction between RhoA and the amino-terminal region of PKN." FEBS Lett.385. 221-224 (1996)

Shibata,H.：“RhoA 与 PKN 氨基末端区域之间相互作用的表征。”

Mukai,H.: "Interaction of PKN with α-actinin." J.Biol.Chem.272. 4740-4746 (1997)

Mukai，H.：“PKN 与 α-辅肌动蛋白的相互作用。”J.Biol.Chem.272-4746（1997）。

Amano,M.: "Identification of a putative target for Rho as the serine-threonine kinase,PKN." Science. 271. 648-650 (1996)

Amano,M.：“确定 Rho 的假定靶标为丝氨酸-苏氨酸激酶 PKN。”