ビタミンD_3活性化酵素の精製と性質の解明

维生素D_3激活酶的纯化及表征

• 批准号: 08780590
• 负责人: 大山 義彦
• 金额: $ 0.7万
• 依托单位: Hiroshima University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08780590/
• 关键词: ビタミンD_3; 25-ヒドロキシビタミンD_3; 1,25-ジヒドロキシビタミンD_3; 25ヒドロキシビタミンD_3 1α-水酸化酵素; チトクロムP450; 酵素精製; カルシウム代謝; 骨形成

1α,25-ジヒドロキシビタミンD_3(1,25(OH)_2D_3は,小腸でのカルシウム吸収,骨からのカルシウムの動員など生体内でのカルシウム濃度の維持に関与するホルモンである。これまでに1,25(OH)_2D_3は,腎臓ミトコンドリアに存在するチトクロムP450によって25(OH)D_3の1α位が水酸化され生成することが知られている。しかし,未だこの1α-水酸化酵素の精製はなされていない。本研究では以下の手順で1α-水酸化酵素の精製を行った。孵化直後からビタミンD欠損食で3週間飼育したニワトリの腎臓を材料とした。まず,ミトコンドリアをコール酸により可溶化した。この超遠心上清を自作したペンチルセファロースカラム(疎水ゲル)にかけ0.3%エマルゲンで溶出した。つぎにヒドロキシアパタイトカラムを通した。活性は非吸着画分に回収された。これをCM-セファロースカラムで濃縮した後,PorosCMカラムを用いたHPLCにてリン酸緩衝液のグラジエントにより溶出した。これらのカラムクロマトグラフィーでは417nmでヘム蛋白質の溶出をモニターし,ヘムタンパク質を含む画分について25(OH)D_3を基質とし,アドレノドキシン,アドレノドキシンレダクダーゼを加えて水酸化反応を再構成し,1,25(OH)_2D_3の生成量をHPLCにて定量した。最終標品の比活性は10nmol product/min/mg proteinでありミトコンドリアの可溶化上清の2000倍であった。また,P450の比含量は1.3nmol P450/mg proteinであった。以上の方法で,これまでに報告されたものより高い比活性をもつ画分が得られたが,SDSポリアクリルアミド電気泳動では分子量56000付近に2本のバンドが認められた。今後さらにカラム条件を検討するとともに抗体作成を行う予定である。

1 α, 25-No. No, no. 1 OH 25 (OH) _ 2D_3, there is a chain of water acidification at position 25 (OH) D3

项目成果

大山義彦: "25-ヒドロキシビタミンD_3 23-水酸化酵素のcDNAクローニング" 日本骨代謝学会雑誌. 14. 112-112 (1996)

Yoshihiko Oyama：“25-羟基维生素D_3 23-羟化酶的cDNA克隆”日本骨代谢学会杂志14. 112-112(1996)。

大山義彦: "Functional Assesment of Two Vitamin D-responsive Elements in the Rat 25-Hydroxyvitamin D_3 24-Hydroxylase Gene" The Journal of Biological Chemistry. 271,48. 30381-30385 (1996)

Yoshihiko Oyama：“大鼠 25-羟基维生素 D_3 24-羟化酶基因中两种维生素 D 响应元件的功能评估”《生物化学杂志》271,48 (1996)。

大山義彦: "モルモットのビタミンD_3代謝酵素(CYP24)のcDNAスクリーニング" 生化学. 68,7. 657-657 (1996)

Yoshihiko Oyama：“豚鼠中维生素 D_3 代谢酶 (CYP24) 的 cDNA 筛选”，生物化学 68,7 (1996)。