活性型ビタミンD_3による転写調節機構の解明(25-ヒドロキシビタミンD_324-水酸化酵素遺伝子のVDREを用いた補助因子の同定)

阐明活化维生素D_3的转录调节机制（使用25-羟基维生素D_324-羟化酶基因的VDRE鉴定辅因子）

• 批准号: 05771517
• 负责人: 大山 義彦
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Hiroshima University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05771517/
• 关键词: チトクロムP450; ビタミンD_3; 活性型ビタミンD_3; 25-ヒドロキシビタミンD_324水酸化酵素; ビタミンDレセプター; レチノイドXレセプター; ビタミンDレスポンスエレメント; ゲルシフトアッセイ

25-ヒドロキシビタミンD_324-水酸化酵素は活性型ビタミンD_3により著しい誘導される。その転写誘導は活性型ビタミンD_3がビタミンDレセプター(VDR)に結合し,さらに補助因子(核内蛋白質)とヘテロダイマーを形成後,その複合体が転写調節領域にあるビタミンDレスポンスエレメント(VDRE)に結合することによると考えられている。我々は,24-水素化酵素遺伝子のクローニングを行い5'-上流領域についてVDREの検索を行った。プロモーター領域を5'側から順次欠失させCATベクターに組み込み腎臓由来のCOS細胞に導入し活性型ビタミンD_3によるCAT活性の誘導を調べた。その結果,[-167/-102]の領域が応答に関与することが判明した。また[-204/-129]の領域はチミジンキナーゼ,beta-グロビンのプロモーターを介して,その挿入方向に依存することなくビタミンD応答を媒介した。これらCATアッセイにより重要性が示唆された領域について既知のVDREとの相同性の比較を行い,可能性のある配列を選び,ゲルシフトアッセイに用いた。このとき,核抽出液はCOS細胞より調整し,VDR,RXRはそれぞれのcDNAからin vitro翻訳系で合成し使用した。バンドシフトは活性型ビタミンD_3,VDR,COS細胞核抽出液(またはRXR)の3成分が存在するときのみに認められた。核抽出液でもRXRを用いた場合でも,シフトしたバンドの電気泳動上の移動度は同じであった。腎臓にはRXRが存在していることを考え合わすとCOS細胞中のVDRとヘテロダイマーを形成する因子はRXRであると考えられた。以上の結果から本酵素の活性型ビタミンD_3による誘導は[-153/-137]のAGGTGAgtgAGGGCGの塩基配列を介してなされ,このVDREにはVDRとRXRと考えられる核内蛋白質が結合することが判明した。

25-ヒドロキシビタ <s:1> D_324- water acidification enzyme ビタ active type ビタ <s:1> D_3によ and <s:1> ヒドロキシビタ induced される. そ の induced は activity type planning write ビ タ ミ ン D_3 が ビ タ ミ ン D レ セ プ タ ー system (VDR) に し, さ ら に subsidy factor, a protein within the nuclear と ヘ テ ロ ダ イ マ ー を, after the formation of そ の complex が planning, regulating field に あ る ビ タ ミ ン D レ ス ポ ン ス エ レ メ ン ト (VDRE) に す る こ と に よ る と exam え ら れ て い る. I 々 は, 24 - traces of water element phenoloxidase 伝 son の ク ロ ー ニ ン グ を line い 5 '- the upper field に つ い て VDRE の 検 cable line を っ た. を プ ロ モ ー タ ー field 5 'side か ら progressive owe lost さ せ CAT ベ ク タ ー に group み 込 み routine renal origin の cosine type ビ に import し activity タ ミ ン D_3 に よ る CAT activity induced を の adjustment べ た. As a result, the が応 in the [-167/-102] <s:1> field is related to に and する する とが とが is determined to be た. ま た - 204 / - 129 の field は チ ミ ジ ン キ ナ ー ゼ, beta - グ ロ ビ ン の プ ロ モ ー タ ー を interface し て, そ の に scions into the direction dependent す る こ と な く ビ タ ミ ン D 応 answer を medium し た. こ れ ら CAT ア ッ セ イ に よ り importance が in stopping さ れ た field に つ い て already know の VDRE と の identity の is を い, possibility の あ る match column を び, ゲ ル シ フ ト ア ッ セ イ に with い た. こ の と き, nuclear extract は COS cell よ り adjust し, VDR, RXR は そ れ ぞ れ の cDNA か ら で synthesis in vitro turn 訳 department し use し た. バ ン ド シ フ ト は activity type ビ タ ミ ン D_3, VDR, COS the nucleus extract (ま た は RXR) の 3 ingredients が exist す る と き の み に recognize め ら れ た. The nuclear extract で <s:1> RXRを is used in the <s:1> た situation of で <e:1>,シフト たバ たバ ド ド ド ド ド ド to move the <s:1> mobility <e:1> of the <s:1> electric charge in た た conditions, which is the same as that in じであった. Renal viscera に は RXR が exist し て い る こ と を exam え close わ す と COS cells system の VDR と ヘ テ ロ ダ イ マ ー を form す る factor は RXR で あ る と exam え ら れ た. の above results か ら の this enzyme activity type ビ タ ミ ン D_3 に よ る induced は - 153 / - 137 の AGGTGAgtgAGGGCG の salt base with column を interface し て な さ れ, こ の VDRE に system は VDR と RXR と exam え ら れ る intranuclear protein が combining す る こ と が.at し た.

项目成果

大山義彦: "25-ヒドロキシビタミンD_324-水酸化酵素遺伝子のビタミンDレスポンスエレメントの同定" 日本骨代謝学会雑誌. 11. 128-128 (1993)

Yoshihiko Oyama：“25-羟基维生素 D_324-羟化酶基因中维生素 D 反应元件的鉴定”日本骨代谢学会杂志 11. 128-128 (1993)。

大山義彦: "Sequence elements in the Rat 25-hydroxy vitaminD_324-hydroxylase which confer responsiveness to vitaminD" Journal of Bone and Mineral Research. 8. 137-137 (1993)

Yoshihiko Oyama：“大鼠 25-羟基维生素 D_324-羟化酶中赋予维生素 D 反应性的序列元素”《骨与矿物质研究杂志》8. 137-137 (1993)。

大山義彦: "ビタミンD_324-水酸化酵素遺伝子のビタミンDレスポンスエレメントの同定" 第9回ビタミンDワークショップ プログラム抄録集. 28-29 (1993)

Yoshihiko Oyama：“维生素 D_324-羟化酶基因中维生素 D 反应元件的鉴定”第 9 届维生素 D 研讨会计划摘要（1993 年）。

大山義彦: "Identification of a VitaminD-responsive element in the 5'-flanking region of the rat 25-kydroxyvitaminD_324hydroxylase gene" The Journal of Biological Chemistry. (印刷中). (1994)

Yoshihiko Oyama：“大鼠 25-羟基维生素 D_324 羟化酶基因 5 侧翼区域维生素 D 响应元件的鉴定”《生物化学杂志》（1994 年出版）。

内田素行: "Protein kinase C upregulated 1alpha,25-dihydroxyvitaminD_3-induced expression of 24-hydroxylase gene" Journal of Bone and Mineral Research. 8. 171-171 (1993)

Motoyuki Uchida：“蛋白激酶 C 上调 1α,25-二羟基维生素 D_3 诱导的 24-羟化酶基因表达”《骨与矿物质研究杂志》，8. 171-171 (1993)。