ビタミンD_3代謝酵素の分子生物学的研究(25-ヒドロキシビタミンD_323-水酸化酵素の同定)

ラットでは,25-ヒドロキシビタミンD_324-水酸化酵素は活性型ビタミンD_3(1,25(OH)_2D_3)により著しく誘導される。そのメカニズムとして,1,25(OH)_2D_3がビタミンDレセプター(VDR)に結合した後,RXRとダイマーを形成し,それがプロモーター領域にあるビタミンDレスポンスエレメント(VDRE)に結合し転写を活性化することを明らかにした。この24-水酸化活性はラット,マウスで顕著であり,モルモットなどの動物種では23-水酸化活性が認められ24-水酸化活性は非常に低い。しかし,2つの酵素の誘導,生理的役割と,チトクロムP-450の酵素の性質を考え合わすと,2つの酵素は同じファミリーである可能性が高い。そこで,24-水酸化酵素のcDNAを用いて23-水酸化酵素cDNAライブラリーをスクリーニングした。4週齢のモルモットに2.5μg/日の1,25(OH)_2D_3を2日連続投与し,腎臓からmRNAを調製した。ラットのcDNAのコーディング領域をプローブとしnorthernblottingを行った結果,ラットより僅かに小さい3.2kbのバンドが検出できた。したがって,モルモットにもラットの24-水酸化酵素と相同性を持つ遺伝子が存在することが明らかとなった。さらに,このmRNAは活性型ビタミンD投与により誘導されることから,モルモットの24-,または23-水酸化酵素であることが期待される。そこで,クローニングためにmRNAのサイズ分画を行い,oligo(dT)プライマーによりcDNAを合成しλgt10を用いライブラリーを作製した。およそ30万のプラークをスクリーニングしたところ,6つのポジティブシグナルが得られた。しかし,これらのクローンのインサートサイズは0.9〜1.2kbpとnorthernblottingから予想されたものより小さかった。現在,この6つのロリーンの塩基配列の決定,新たにランダムプライマーを用いたcDNAライブラリーの作製,5´-RACE法を進めている。

ラットでは,25-ヒドロキシビタミンD_324-水酸化酵素は活性型ビタミンD_3(1,25(OH)_2D_3)により著しく誘導される。そのメカニズムとして,1,25(OH)_2D_3がビタミンDレセプター(VDR)に結合した後,RXRとダイマーを形成し,それがプロモーター領域にあるビタミンDレスポンスエレメント(VDRE)に結合し転写を活性化することを明らかにした。この24-水酸化活性はラット,マウスで顕著であり,モルモットなどの動物種では23-水酸化活性が認められ24-水酸化活性は非常に低い。しかし,2つの酵素の誘導,生理的役割と,チトクロムP-450の酵素の性質を考え合わすと,2つの酵素は同じファミリーである可能性が高い。そこで,24-水酸化酵素のcDNAを用いて23-水酸化酵素cDNAライブラリーをスクリーニングした。4週齢のモルモットに2.5μg/日の1,25(OH)_2D_3を2日連続投与し,腎臓からmRNAを調製した。ラットのcDNAのコーディング領域をプローブとしnorthernblottingを行った結果,ラットより僅かに小さい3.2kbのバンドが検出できた。したがって,モルモットにもラットの24-水酸化酵素と相同性を持つ遺伝子が存在することが明らかとなった。さらに,このmRNAは活性型ビタミンD投与により誘導されることから,モルモットの24-,または23-水酸化酵素であることが期待される。そこで,クローニングためにmRNAのサイズ分画を行い,oligo(dT)プライマーによりcDNAを合成しλgt10を用いライブラリーを作製した。およそ30万のプラークをスクリーニングしたところ,6つのポジティブシグナルが得られた。しかし,これらのクローンのインサートサイズは0.9〜1.2kbpとnorthernblottingから予想されたものより小さかった。現在,この6つのロリーンの塩基配列の決定,新たにランダムプライマーを用いたcDNAライブラリーの作製,5´-RACE法を進めている。