核内受容体転写制御に関わる新規共役因子の同定及び解析

(1)ビタミンD受容体(VDR)とVAF1の結合酵母two-hybrid systemを用いて単離したVDRと結合する因子VAF1は、細胞内結合実験(酵母内two-hybrid法)及び試験管内結合実験(GST pull-down法、Far-western法)においても結合を確認することができた。また、VAF1欠損変異株を用いVAF1上の結合部位を解析すると、カルシウム結合部位として知られるEF-hand motifをVDRは認識・結合することを明らかにした。その結合はカルシウムにより阻害を受けた。また、VDR欠損変異株を用いた結合実験よりVAF1はVDRのDからE領域を認識・結合した。以上結合実験の結果より従来知られていた転写共役因子とは異なることが明らかとなった。第一に核内受容体スーパーファミリーの中でVDR特異的に結合することであり、第二にリガンド結合中心部位と異なる部位(VDRのDからE領域)に結合する。最後にリガンド非依存的に結合する点である。(2)VDRとEF-hand motifの結合さらに、他のEF-hand motifをもつ三種類のタンパク質ともEF-hand motifを介してVDRは認識・結合した。また、同結合も、カルシウムにより阻害を受けた。(3)VDR転写共役因子の同定・解析以上より、VDRはEF-hand motifを認識・結合するため、3種のEF-hand motifを有するタンパク質について転写共役活性をレポーター遺伝子トランスフェクション法を用いて解析を行ったところ、核内EF-hand motif、ロイシンジッパーを持つ二つのタンパク質がVDR転写共役活性を有することを明らかにした。また、他の転写共役因子と同様、転写共役因子CBPと結合した。よって、二因子は新規転写共役因子であると考えられる(以上投稿中)。

(1)ビタミンD受容体(VDR)とVAF1の結合酵母two-hybrid systemを用いて単離したVDRと結合する因子VAF1は、細胞内結合実験(酵母内two-hybrid法)及び試験管内結合実験(GST pull-down法、Far-western法)においても結合を確認することができた。また、VAF1欠損変異株を用いVAF1上の結合部位を解析すると、カルシウム結合部位として知られるEF-hand motifをVDRは認識・結合することを明らかにした。その結合はカルシウムにより阻害を受けた。また、VDR欠損変異株を用いた結合実験よりVAF1はVDRのDからE領域を認識・結合した。以上結合実験の結果より従来知られていた転写共役因子とは異なることが明らかとなった。第一に核内受容体スーパーファミリーの中でVDR特異的に結合することであり、第二にリガンド結合中心部位と異なる部位(VDRのDからE領域)に結合する。最後にリガンド非依存的に結合する点である。(2)VDRとEF-hand motifの結合さらに、他のEF-hand motifをもつ三種類のタンパク質ともEF-hand motifを介してVDRは認識・結合した。また、同結合も、カルシウムにより阻害を受けた。(3)VDR転写共役因子の同定・解析以上より、VDRはEF-hand motifを認識・結合するため、3種のEF-hand motifを有するタンパク質について転写共役活性をレポーター遺伝子トランスフェクション法を用いて解析を行ったところ、核内EF-hand motif、ロイシンジッパーを持つ二つのタンパク質がVDR転写共役活性を有することを明らかにした。また、他の転写共役因子と同様、転写共役因子CBPと結合した。よって、二因子は新規転写共役因子であると考えられる(以上投稿中)。