膜輸送タンパク質テトラサイクリン/プロトンアンチトランスポータの構造化学的研究

膜转运蛋白四环素/质子反转运蛋白的结构化学研究

• 批准号: 08780621
• 负责人: 喜田 昭子
• 金额: $ 0.7万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08780621/
• 关键词: 膜輸送タンパク質; テトラサイクリン; アンチポ-タ; 結晶化; X線結晶構造解析; タンパク質結晶学

本研究は,テトラサイクリン/プロトンアンチポ-タ(TetAタンパク質)の結晶化を行い,X線結晶構造解析によって三次元構造を決定し,その立体構造に基づいて細胞膜輸送の分子機構を原子レベルで解明しようとするものである.これまでに,最もテトラサイクリン耐性の強いグラム陰性菌のTetAタンパク質(分子量42KDa,アミノ酸残基数401)を研究の対象として結晶化条件の検索を行った.TetAタンパク質はトランスポゾンTn10のTetA遺伝子を大腸菌内で大量発現させたものを用いた.また,タンパク質の親水性部分を増加させたタンパク質(デヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)をTetAタンパク質のN末端に融合させたタンパク質)についても結晶化条件の検索を行った.その結果,TetAタンパク質ではエタノールとポリエチレングリコール(PEG)が,TetA-DHFR融合タンパク質ではそれらに加えて数種類の塩が結晶化の可能性をもつことを見いだし,いくつかの条件でそれぞれのタンパク質について微細な結晶を得た.ほとんどの微結晶は針状結晶であったが,界面活性剤としてドデシルマルトシド,沈殿剤としてポリエチレングリコールモノメチルエーテル550,添加剤に硫酸亜鉛を用い,温度20度,pH6.5で結晶化を行ったときにのみ,1辺の長さが約0.15mmの板状結晶が得られた.回転対陰極型のX線発生装置を用いてX線回折実験を行い静止写真を数枚撮影したところ,低分解能の反射を確認できたが,その結晶がTetAタンパク質由来のものであるかどうかの判断はできなかった.今回確認できた結晶は,いずれも結晶化の再現性に乏しいため,新たな結晶化条件の検索に加えて,それぞれの条件での結晶化の再現性を高めることが今後の重要な課題である.

In this study, the crystallization of TetA (TetA (TetA)), the determination of three-dimensional structure by X-ray crystal structure analysis, and the determination of molecular mechanism of cell membrane transport by three-dimensional structure were studied. In this paper, the TetA gene (molecular weight 42KDa, number of amino acid residues 401) of the most resistant strain was studied. The TetA gene (molecular weight 42KDa, number of amino acid residues 401) of the most resistant strain was found in large quantities in Escherichia coli. In addition, the hydrophilic part of the protein was increased, and the protein (DHFR) was fused to the N-terminal end of the protein. As a result, TetA-DHFR fusion is obtained by adding a number of different kinds of TetA-DHFR fusion substances, such as PEG,TetA-DHFR,TetA-DHFR Microcrystalline needle-like crystals, interfacial active agents, precipitation agents, additives lead sulfate, temperature 20 ℃, pH 6.5, crystallization, plate-like crystals up to about 0.15 mm in length. X-ray reflection of low resolution energy is confirmed by several images, and the crystal is determined by the origin of the quality. It is confirmed that the reproducibility of crystallization is insufficient, and the new crystallization conditions are improved, and the reproducibility of crystallization is high.