抗原抗体反応を用いた魚病性細菌の迅速・高感度検出法の確立に関する研究

建立基于抗原抗体反应的鱼类病原菌快速高灵敏检测方法的研究

• 批准号: 09760191
• 负责人: 遠藤 英明
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: 東京水産大学
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 1998
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09760191/
• 关键词: フローサイトメトリー; 抗原抗体反応; 腸球菌; バイオアッセイ; 魚病

本研究は,抗原抗体反応とフローサイトメトリー(FCM)を用いた高感度かつ迅速・簡便な魚病性細菌検出法の確立を目的とした。平成9年度では,FCMによる各種海洋細菌の生菌数測定法の確立及び魚病性細菌Lactococcus garvieae特異的抗体の作製を行った。その結果,FCMによる菌数測定では,10^4〜10^8cells/ml範囲において平板培養法による測定結果との間に良い相関が認められた。またL.garvieaeをフロインドアジュバントとともにウサギに免疫し,その抗血清を作製したところ,本菌体に強い特異性を示すことが認められた。そこで平成10年度ではこれらの知見を基に,FCMを用いた迅速なL.garvieaeの検出を試みた。まず作製した抗L.garvieae抗体の最適反応条件を検討すると共に,FCM測定におけるプロトコールを決定した。次に本抗体を目的の細菌に反応させた後,二次抗体[抗ウサギIgG(H^+L)・Fluorescein isothiocyanate標識]を反応させて蛍光標識し,これをFCMを用いて測定した。その結果,本抗体は1×10^4倍の倍率で抗血清を希釈して用いることにより,L.garvieaeに対して最大の特異性を示した。またE.coliをはじめ,その他の細菌にはほとんど反応しないことが明らかとなった。次にL.garvieae及びE.coliを適当な割合で混合した溶液を調整し,L.garvieaeの特異的検出を行ったところ,10^4〜10^7cells/mlの範囲でその測定が可能であった。さらに,FCMによる一検体の測定所要時間は2分間であり,抗原抗体反応等の前処理を含めても3時間以内での測定が可能であった。したがって従来より用いられている平板計数法に比べて極めて迅速に測定を行えることが明らかとなった。

The purpose of this study is to establish a high-sensitivity, rapid and simple method for detecting fish disease bacteria using antigen-antibody antibodies and Fluorometricine (FCM). In 2009,FCM was used to establish a method for determining the number of marine bacteria and to prepare antibodies specific to Lactococcus garvieae. The results of the FCM assay were 10^4 ~ 10^8 cells/ml, and the results of the plate culture assay were well correlated. L.garvieae is a highly specific strain of the virus. In 2010, the FCM adopted a new approach to the issue of L. garviees. The optimal reaction conditions for the production of anti-L.garvieae antibodies were investigated and determined by FCM assay. The secondary antibody [anti-IgG (H^+L)·Fluorescein isocyanate label] was detected by FCM after the secondary antibody was detected against the target bacteria. As a result, the antibody showed maximum specificity against L.garvieae at 1×10^4 fold magnification. E.coli is the most common strain of E. coli. L.garvieae and E.coli were mixed and adjusted appropriately, and the specific detection of L.garvieae was performed at a range of 10^4 ~ 10^7 cells/ml. In addition, the time required for FCM detection of a sample is less than 2 minutes, and the pre-treatment of antigen antibody reaction is less than 3 minutes. The plate counting method is used to determine the amount of water in the water.

项目成果

H.Endo et al.: "Application of Flow Cytometry for Rapid Detection of Lactococcus garvieas." Appl.Biochem.Biotechnol.(in press).

H.Endo 等人：“流式细胞术在快速检测加维乳球菌中的应用”。

H.Endo et al.: "Application of Flow Cytometry for Rapid Determination of Cell Number of Viable Bacteria." Fisheries Science. 63. 1024-1029 (1997)

H.Endo 等人：“应用流式细胞仪快速测定活细菌的细胞数”。