臍帯平滑筋の増殖調節とその異常に関する分子生物学的研究

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本年度は昨年に引き続き臍帯の分化及び老化を分子レベルで解析した。特に臍帯の分化及び老化にアポトーシスが関与するか否かを調べた。アポトーシス関連因子bcl-2を組織レベル、タンパクレベル、遺伝子レベルで解析し、実際にアポトーシスが起きているかどうか検討した。bcl-2について組織レベルで解析を行い、TUNEL(TdT-mediated dUTP-biotin nick end labelling)法を用いてアポトーシスを検出した結果、僅かにアポトーシスが検出されたが、臍帯の週齢別では変化が無かった。また患者の同意を得た上で得られた正常臍帯動脈をcell lysis buffer中にてホモジネートしてタンパク質を抽出し、各30μgをSDS-PAGEにて分離、Western blotting法にてニトロセルロースフィルターに移してbcl-2の抗体を反応させ、ECLキットを用いて蛍光反応によりタンパク質発現を解析したがbcl-2のタンパク質の量は、臍帯の各週齢別では変化が無かった。次に臍帯の分化及び老化に老化関連因子であるテロメラーゼが関与するか否かを検討した。患者の同意を得た上で得られた正常臍帯動脈をcell lysis buffer中にてホモジネートしてタンパク質を抽出し、テロメラーゼアッセイを行った。抽出したタンパク質中のテロメラーゼはその3'末端にtelomeric repeatsという特定の配列を作るので、3'末端にtelomeric repeatsの配列を作らせ、telomerase productsはその3'末端にtelomeric repeatsの配列と、その配列に相補的なプライマーCX[5'-(CCCTTA)_3 CCCTAA-3']とdNTPを臍帯組織抽出液と混合し、PCRにて増幅、そのproductsを電気泳動にて検出した。その結果、各週齢の違った臍帯抽出したタンパク質では、各週齢でのテロメラーゼ活性の違いが見出せなかった。本課題全体を通じて、臍帯の発生ではその初期に、Cyclin Eが強く発現することを明らかにすることができた。