アポトーシス関連因子ALG－2の機能に関する構造生物学的解析

凋亡相关因子ALG-2功能的结构生物学分析

• 批准号: 10J06388
• 负责人: 犬塚 達俊
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2010
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2010 至 2012
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10J06388/
• 关键词: ALG-2; カルシウム結合タンパク質; 立体構造; モチーフ; エンドソーム; 分泌; エクソソーム; 脂質付加; PLSCR3; exosome; palmitoylation; crystal structu; apoptosis; crystal structure; Sec31A; COP II; cell death

ALG-2がカルシウム依存的に結合するPLSCR3のII型モチーフは、ALIXなどのI型モチーフの結合部位とは異なる部位に結合することが変異体を用いた解析より推測されていた。既知のALG-2の立体構造をタンパク質表面上の疎水ポケットを予測するコンピュータープログラムを用いて解析したところ、新たなポケットが見出され、PLSCR3のII型モチーフの仮想ペプチド構造とのドッキングシミュレーションによって、このポケットにII型モチーフが結合する可能性が示唆された。結合に関与する可能性のあるアミノ酸を別の残基に置換したALG-2変異体を調製し、PLSCR3との結合を解析したところ、予想されたように結合能の低下が観察され、シミュレーション結果が正しいことが強く示唆された。PLSCR3はシグナルペプチドをもたないが、細胞外に分泌されることをすでに見出していたが、その形態をより詳細に解析した。分泌されたPLSCR3は10万g沈殿画分に回収され、プロテアーゼ抵抗性、界面活性化剤存在下でのプロテアーゼ感受性、10万g沈殿画分のショ糖密度勾配超遠心解析より算出される密度より、PLSCR3はエクソソームに存在することが判明した。PLSCR3にはシグナルペプチドが存在しないため、小胞体・ゴルジ体を経ずに別のメカニズムによって分泌されることが想定された。PLSCR3の細胞内局在解析により、PLSCR3は多胞性エンドソームを経由して細胞外に放出されることが示唆された。また、PLSCR3のパルミチン酸付加部位の変異体は分泌されず核に移行することも分かった。ALG-2結合部位の欠損変異体も分泌されることから、ALG-2は分泌に対して直接には関与していないと思われる。

ALG - 2 が カ ル シ ウ ム dependent に combined す る PLSCR3 の II モ チ ー フ は, ALIX な ど の type I モ チ ー フ の combining site と は different な に る parts combine す る こ と が - variant を with い た parsing よ り speculation さ れ て い た. Both know の ALG - 2 の three-dimensional structure を タ ン パ ク mass on the surface of の 疎 water ポ ケ ッ ト を be す る コ ン ピ ュ ー タ ー プ ロ グ ラ ム を with い て parsing し た と こ ろ, new た な ポ ケ ッ ト が shows さ れ, PLSCR3 の II モ チ ー フ の 仮 think ペ プ チ ド tectonic と の ド ッ キ ン グ シ ミ ュ レ ー シ ョ ン に よ っ て, こ の ポ ケ ッ ト Youdaoplaceholder0 type II モチ フが フが combined with する possibility が indicates された. Combining に masato and す る possibility の あ る ア ミ を don't の ノ acid residues に replacement し た ALG - 2 - variant を modulation し, PLSCR3 と の combining analytical し を た と こ ろ, to want to さ れ た よ う に binding energy low の が 観 examine さ れ, シ ミ ュ レ ー シ ョ が ン results are し い こ と が く and shown strong sucking さ れ た. PLSCR3 は シ グ ナ ル ペ プ チ ド を も た な い が and secretion of extracellular に さ れ る こ と を す で に shows し て い た が, そ の form を よ り detailed analytical し に た. Secretion さ れ た PLSCR3 は に Shen Dian draw points back to the 100000 g 収 さ れ, プ ロ テ ア ー ゼ resistance and interfacial activity tonic in the presence of で の プ ロ テ ア ー ゼ sensibility, 100000 g Shen Dian points の シ ョ with vast heart actually sugar density resolution よ り calculate さ れ る density よ り, PLSCR3 は エ ク ソ ソ ー ム に exist す る こ と が.at し た. PLSCR3 に は シ グ ナ ル ペ プ チ ド が exist し な い た め, small cell body ゴ ル ジ body を 経 ず に don't の メ カ ニ ズ ム に よ っ て secretion さ れ る こ と が scenarios さ れ た. PLSCR3 の cells inside bureau in parsing に よ り, PLSCR3 は multiple cell エ ン ド ソ ー ム を 経 by し て extracellular に release さ れ る こ と が in stopping さ れ た. Youdaoplaceholder0, PLSCR3 <s:1> パ パ パ チ <s:1> チ <s:1> acidate addition site <s:1> variant secrete されず nuclear に transition する と と <s:1> part った った った ALG - 2 combining site の owe loss - variant も secretion さ れ る こ と か ら, ALG - 2 は secretion に し seaborne て directly に は masato and し て い な い と think わ れ る.

项目成果

Phospholipid scramblase 3 のエキソソーム経路による細胞外分泌に関する研究

磷脂扰乱酶3通过外泌体途径分泌到细胞外的研究

• 发表时间: 2012
• 作者: 犬塚達俊;猪川亮;木津久美子;柴田秀樹;成田宏史;牧正敏
• 通讯作者: 牧正敏

Prediction of a new ligand-binding site for type 2 motif based on the crystal structure of ALG-2 by dry and wet approaches.

• DOI: 10.3390/ijms13067532
• 发表时间: 2012
• 期刊: International journal of molecular sciences
• 影响因子: 5.6
• 作者: Takahashi T;Suzuki H;Inuzuka T;Shibata H;Maki M
• 通讯作者: Maki M

The ALG-2 Binding Site in Sec31A Influences the Retention Kinetics of Sec31A at the Endoplasmic Reticulum Exit Sites as Revealed by Live-Cell Time-Lapse Imaging

• DOI: 10.1271/bbb.100215
• 发表时间: 2010-09-01
• 期刊: BIOSCIENCE BIOTECHNOLOGY AND BIOCHEMISTRY
• 影响因子: 1.6
• 作者: Shibata, Hideki;Inuzuka, Tatsutoshi;Maki, Masatoshi
• 通讯作者: Maki, Masatoshi

Translocation of phospholipid scramblase 3 into nucleus by palmitoylation inhibition

通过棕榈酰化抑制将磷脂扰乱酶 3 转入细胞核

• 发表时间: 2012
• 作者: 犬塚達俊;猪川亮;木津久美子;柴田秀樹;成田宏史;牧正敏
• 通讯作者: 牧正敏

Molecular basis for defect in Alix-binding by alternatively spliced isoform of ALG-2 (ALG-2DeltaGF122) and structural roles of F122 in target recognition.

• DOI: 10.1186/1472-6807-10-25
• 发表时间: 2010-08-06
• 期刊: BMC structural biology
• 作者: Inuzuka T;Suzuki H;Kawasaki M;Shibata H;Wakatsuki S;Maki M
• 通讯作者: Maki M