S.mutansピルビン酸ギ酸リアーゼ(PFL)の発現機構の解析

变形链球菌丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)表达机制分析

• 批准号: 09771547
• 负责人: 山本 康人
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: Tokyo Dental College
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 1998
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09771547/
• 关键词: Streptococcus mutans; Pyruvate formate-lyase; PFL activase; sugar alcohol metabolism; PFL activeting enzyme

嫌気的条件下のS.mutans糖代謝系で,重要な役割を担っているビルビン酸ギ酸リアーゼ(PFL)はラジカル酵素であり,その活性化にはラジカル形成に関与するPFL活性化酵素(PFLactivase)の存在が必須である.S.mutansのDPFL活性化酵素遺伝子(act)は,E.coli等のそれと違い,PFL遺伝子の下流には存在しなかった.よって,報告のあったact数種の情報をもとに,アミノ酸残基間で相同性の高い領域を選定してプライマーを合成し,S.mutansGS-51S3株の染色体DNAを鋳型としてPCR反応を行い,act断片をクローニングした.そして,このact断片の情報をもとにゲノムウォーキング法等により全act領域をクローニングし,瑞基配列を決定した.S.mutansのact(塩基数789)は,263アミノ酸残基をコードしており,推定分子量は30148で,E.coliのそれとのアミノ酸残基間における相同性は,43.8%,identical;79.3%,conservedであった.E.coliにおいてPFLactivaseの活性中心と報告されたCys-29,Cys-33,Cys-36の領域は,S.mutansではCys-37,Cys-41,CyS-44の領域として保存されていた.また,親株染色体DNA上のCDS領域に,Campbellタイプの相同組換えによってベクター領域と抗生物質耐性遺伝子を挿入して作製した変異株YASC9YK2(act-mutant/PFLactivase,-)では,PFL活性は検出されなかった(PFLactivaseは,PFLにラジカルを導入してPFLを活性化する酵素であり,活性を直接的に測定することは出来ない.よってPFLactivase活性は,PFL活性化系における計時的なPFL活性の上昇として検出した).しかし,SAKC5Y2C1(pfl-mutant/PFL,ー)とYASC9YK2のcell-freeの菌体内抽出成分を混合して,変異株同士によるPFL活性化系の再構成を行うと,親株の76.5%に相当するPFL活性が検出された. ー論文投稿準備中ー

Too 気 conditions の S.m utans sugar metabolism で, cut を bear important な service っ て い る ビ ル ビ ン acid ギ acid リ ア ー ゼ (PFL (persistent functional language)) は ラ ジ カ ル enzyme で あ り, そ の activeness に は ラ ジ カ ル form に masato and す る PFL (persistent functional language) active phenoloxidase (PFLactivase) must exist の が で あ る. S.m utans の DPF L active phenoloxidase heritage 伝 は (act), the e.c. with our fabrication: oli etc. の そ れ と violations い, PFL (persistent functional language) heritage 伝 の son nasty に は exist し な か っ た. よ っ て, report の あ っ た act several の intelligence を も と に, ア ミ ノ acid residues between で identity の high を い field selected し て プ ラ イ マ ー し を synthesis, S.m utansGS - 51 s3 の strains Chromosome DNA を type where と し て PCR anti 応 を い, act fragment を ク ロ ー ニ ン グ し た. そ し て, こ の act fragment の intelligence を も と に ゲ ノ ム ウ ォ ー キ ン グ method に よ り act all field を ク ロ ー ニ ン グ し, rickey match column を decided し た. S.m utans の act (789) salt base は, 263 ア ミ ノ acid residues を コ ー ド し て お り, presumption of molecular weight 30148 で は, e.c. with our fabrication: oli の そ れ と の ア ミ ノ acid residues between に お け る gay は, 43.8%, and the identical; 79.3%, conserved で あ っ た. E.c. with our fabrication: oli に お い て PFLactivase の active center と report さ れ た Cys - 29, Cys - 33, Cys - 36 は の areas, S.m utans で は Cys to 37, Cys - 41, Cys - 44 の field と し て save さ れ て い た . ま た, parent strain chromosome DNA の CDS sector に, Campbell タ イ プ の in same group え に よ っ て ベ ク タ ー field と antibiotic substances patience heritage 伝 son を scions into し て cropping し た - different strains YASC9YK2 (act - mutant/PFLactivase, -) で は, PFL (persistent functional language) active は 検 out さ れ な か っ た (PFLactivase は, PFL (persistent functional language) に ラ ジ カ ル を import し て PFL (persistent functional language) を activeness す る enzyme で あ り, active を direct determination of に す る こ と は out な い. よ っ て PFLactivase active は PFL (persistent functional language) activeness is に お け る timed な PFL (persistent functional language) active の rise と し て 検 out し た). し か し, SAKC 5 y2c1 (PFL (persistent functional language) - mutant/PFL (persistent functional language), ー) と YASC9YK2 の cell - free の bacteria in the body take composition を mixed し て, variations with different strains and に よ る PFL (persistent functional language) activeness is の to constitute を line う と, parent strain の 76.5% に quite す る PFL (persistent functional language) active が 検 out さ れ た. ー ー paper submitted to prepare