副甲状腺ホルモンによる骨シアロタンパク質の転写の調節

甲状旁腺激素对骨唾液蛋白转录的调节

• 批准号: 09771650
• 负责人: 小方 頼昌
• 金额: $ 0.51万
• 依托单位: Nihon University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 1998
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09771650/
• 关键词: 骨シアロタンパク質; 細胞外マトリックス; PTH; 遺伝子プロモーター; 転写因子; 分子生物学; 石灰化; 下垂体特異的転写活性化因子; 組織特異性

1.骨芽細胞様細胞であるROS17/2.8細胞にヒト1-34副甲状腺ホルモン(PTH;10^<-8>M)を添加後,RNAを抽出しノーザンブロットを行った結果,BSPmRNA量は6時間後に約5倍に上昇し,その後徐々に低下した。タンパク合成阻害剤であるシクロヘキシミドを同時投与すると,PTH刺激によるBSPmRNAの上昇が消失することから,PTHの効果はタンパク合成を介する間接的なものであると考えられた。次に,PTHがmRNAの安定性に影響を与えるか否かを転写阻害剤を用いて検討したところ,PTHはBSPmRNAの半減期を変化させないことが判明した。2.BSPの遺伝子上流域プロモーターの活性を検索する目的で,ルシフェラーゼアッセイを行った。ルシフェラーゼベクターに,種々の長さに調節したプロモーター遺伝子を挿入し,ROS17/2.8細胞へリポフェクチンにて導入した。PTH刺激によりBSPプロモーターの116塩基上流を含むコンストラクトでルシフェラーゼ活性の上昇が認められた。BSPプロモーターの116塩基上流にはサイクリックAMPレスポンスエレメント(CRE)および下垂体特異的転写活性化因子(pituitary-specific transcription factor-1;Pit-1)結合配列に類似した配列が存在するが,Pit-1配列の上流約半分を欠失したコンストラクトではCRE配列を含んでいるにもかかわらず,PTH刺激でルシフェラーゼ活性の上昇が認められなかった。以上の結果より,BSPプロモーター中のPit-1に類似した配列を介してPTHによる転写の調節が行われていると考えられた。3.BSPプロモーター中のPit-1配列をアイソトープで標識し,ゲルシフトアッセイにて核内タンパク質との結合性の検索を行った結果,Pit-1配列とコンフルエント後のROS17/2.8細胞核内タンパク質との複合体が観察された。この複合体は抗pit-1抗体と反応し,さらにPTH刺激により減少した。PTHはROS17/2.8細胞においてBSPのmRNA量を上昇させることから,Pit-1はBSPの転写を抑制し,PTH刺激によりPit-1が減少してBSPの転写を進行させると考えられた。

1。将人1-34甲状旁腺激素（PTH; 10^<-8> m）加到ROS17/2.8细胞（是成骨细胞样细胞）后，提取并北部染上了RNA。 6小时后，BSP mRNA的量增加了约5次，然后逐渐减少。蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺的共同给药消除了PTH刺激引起的BSP mRNA的升高，并且人们认为PTH的效果是通过蛋白质合成间接介导的。接下来，我们研究了PTH是否使用转录抑制剂影响mRNA的稳定性，发现PTH不会改变BSP mRNA的半衰期。 2。进行荧光素酶测定，以搜索BSP基因上游启动子的活性。将荧光素酶载体与调节的启动子基因插入，并引入带有Lipofectin的ROS17/2.8细胞中。 PTH刺激显示在包含BSP启动子上游的116个碱基的构建体中荧光素酶活性的增加。尽管有类似于环状AMP响应元件（CRE）和垂体特异性转录因子1的序列； PIT-1结合序列116碱基在BSP启动子的上游，尽管观察到PTH刺激时未观察到荧光素酶活性的增加，尽管事实上，PIT-1序列上游约一半的构建体删除了包含CRE序列的一半。从以上结果来看，可以通过与BSP启动子类似的PIT-1进行调节PTH的转录。 3。用同位素标记了B​​SP启动子中的PIT-1序列，并使用凝胶移位测定法搜索了核蛋白的结合特性，并且观察到PIT-1序列与汇合ROS17/2.8细胞核蛋白之间的复合物。该复合物与抗Pit-1抗体反应，并通过PTH刺激进一步降低。 PTH增加了ROS17/2.8细胞中BSP mRNA的量，被认为PIT-1抑制BSP转录和PTH刺激会减少PIT-1并进展BSP转录。

项目成果

LiJJ et al.: "Characteristics of vitamin D_3 receptor binding to the vitamin D response element in rat bone sialoprotein gene promoter." Eur. J. Oral Science. Vol.106. 408-417 (1998)

LiJJ 等人：“维生素 D_3 受体与大鼠骨唾液蛋白基因启动子中维生素 D 反应元件结合的特征。”