副甲状腺ホルモンによる骨シアロタンパク質の転写の調節

甲状旁腺激素对骨唾液蛋白转录的调节

• 批准号: 09771650
• 负责人: 小方 頼昌
• 金额: $ 0.51万
• 依托单位: Nihon University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 1998
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09771650/
• 关键词: 骨シアロタンパク質; 細胞外マトリックス; PTH; 遺伝子プロモーター; 転写因子; 分子生物学; 石灰化; 下垂体特異的転写活性化因子; 組織特異性

1.骨芽細胞様細胞であるROS17/2.8細胞にヒト1-34副甲状腺ホルモン(PTH;10^<-8>M)を添加後,RNAを抽出しノーザンブロットを行った結果,BSPmRNA量は6時間後に約5倍に上昇し,その後徐々に低下した。タンパク合成阻害剤であるシクロヘキシミドを同時投与すると,PTH刺激によるBSPmRNAの上昇が消失することから,PTHの効果はタンパク合成を介する間接的なものであると考えられた。次に,PTHがmRNAの安定性に影響を与えるか否かを転写阻害剤を用いて検討したところ,PTHはBSPmRNAの半減期を変化させないことが判明した。2.BSPの遺伝子上流域プロモーターの活性を検索する目的で,ルシフェラーゼアッセイを行った。ルシフェラーゼベクターに,種々の長さに調節したプロモーター遺伝子を挿入し,ROS17/2.8細胞へリポフェクチンにて導入した。PTH刺激によりBSPプロモーターの116塩基上流を含むコンストラクトでルシフェラーゼ活性の上昇が認められた。BSPプロモーターの116塩基上流にはサイクリックAMPレスポンスエレメント(CRE)および下垂体特異的転写活性化因子(pituitary-specific transcription factor-1;Pit-1)結合配列に類似した配列が存在するが,Pit-1配列の上流約半分を欠失したコンストラクトではCRE配列を含んでいるにもかかわらず,PTH刺激でルシフェラーゼ活性の上昇が認められなかった。以上の結果より,BSPプロモーター中のPit-1に類似した配列を介してPTHによる転写の調節が行われていると考えられた。3.BSPプロモーター中のPit-1配列をアイソトープで標識し,ゲルシフトアッセイにて核内タンパク質との結合性の検索を行った結果,Pit-1配列とコンフルエント後のROS17/2.8細胞核内タンパク質との複合体が観察された。この複合体は抗pit-1抗体と反応し,さらにPTH刺激により減少した。PTHはROS17/2.8細胞においてBSPのmRNA量を上昇させることから,Pit-1はBSPの転写を抑制し,PTH刺激によりPit-1が減少してBSPの転写を進行させると考えられた。

1. When ROS17/2.8 cells were cultured in vitro, PTH (10^<-8>M) was added and RNA was extracted. As a result, BSP mRNA increased 5-fold after 6 hours and then decreased gradually. The increase of BSP mRNA in PTH stimulated cells disappeared, and the effect of PTH on BSP synthesis was indirect. Secondly, the impact of PTH on the stability of mRNA and the use of write inhibitors have been investigated, and it has been determined that PTH has a significant effect on the half-life of BSPmRNA. 2. The BSP's upstream watershed activity is monitored for the purpose of monitoring the activity. The gene was introduced into ROS17/2.8 cells by the regulation of cell growth. PTH stimulation increases BSP activity at 116 ° C. BSP and CRE (116-base up-stream) are associated with pitary-specific transcription factor-1 (Pit-1) binding alignment, and similar alignment exists. Pit-1 alignment is approximately half-way up the up-stream and CRE alignment is partially absent, and PTH stimulation activity increases. As a result, Pit-1 in BSP is similar to Pit-1 in PTH. 3. Pit-1 alignment in BSP was identified by the binding model of the nuclear protein in ROS17/2.8 cells after Pit-1 alignment. This complex responds to anti-pit-1 antibodies and is reduced by PTH stimulation. PTH ROS17/2.8 cells were stimulated with BSP mRNA levels increased and Pit-1 mRNA levels decreased.

项目成果

LiJJ et al.: "Characteristics of vitamin D_3 receptor binding to the vitamin D response element in rat bone sialoprotein gene promoter." Eur. J. Oral Science. Vol.106. 408-417 (1998)

LiJJ 等人：“维生素 D_3 受体与大鼠骨唾液蛋白基因启动子中维生素 D 反应元件结合的特征。”