副甲状腺ホルモンによる骨シアロタンパク質の転写の調節

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1.骨芽細胞様細胞であるROS17/2.8細胞にヒト1-34副甲状腺ホルモン(PTH;10^<-8>M)を添加後,RNAを抽出しノーザンブロットを行った結果,BSPmRNA量は6時間後に約5倍に上昇し,その後徐々に低下した。タンパク合成阻害剤であるシクロヘキシミドを同時投与すると,PTH刺激によるBSPmRNAの上昇が消失することから,PTHの効果はタンパク合成を介する間接的なものであると考えられた。次に,PTHがmRNAの安定性に影響を与えるか否かを転写阻害剤を用いて検討したところ,PTHはBSPmRNAの半減期を変化させないことが判明した。2.BSPの遺伝子上流域プロモーターの活性を検索する目的で,ルシフェラーゼアッセイを行った。ルシフェラーゼベクターに,種々の長さに調節したプロモーター遺伝子を挿入し,ROS17/2.8細胞へリポフェクチンにて導入した。PTH刺激によりBSPプロモーターの116塩基上流を含むコンストラクトでルシフェラーゼ活性の上昇が認められた。BSPプロモーターの116塩基上流にはサイクリックAMPレスポンスエレメント(CRE)および下垂体特異的転写活性化因子(pituitary-specific transcription factor-1;Pit-1)結合配列に類似した配列が存在するが,Pit-1配列の上流約半分を欠失したコンストラクトではCRE配列を含んでいるにもかかわらず,PTH刺激でルシフェラーゼ活性の上昇が認められなかった。以上の結果より,BSPプロモーター中のPit-1に類似した配列を介してPTHによる転写の調節が行われていると考えられた。3.BSPプロモーター中のPit-1配列をアイソトープで標識し,ゲルシフトアッセイにて核内タンパク質との結合性の検索を行った結果,Pit-1配列とコンフルエント後のROS17/2.8細胞核内タンパク質との複合体が観察された。この複合体は抗pit-1抗体と反応し,さらにPTH刺激により減少した。PTHはROS17/2.8細胞においてBSPのmRNA量を上昇させることから,Pit-1はBSPの転写を抑制し,PTH刺激によりPit-1が減少してBSPの転写を進行させると考えられた。