中枢作働成分、crocinに対するモノクローナル抗体の作製とその応用

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平成9年度は、実施計画に従い、crocinに対するモノクローナル抗体(MAb)の作製を行った。数種の抗crocinMAb産生ハイブリドーマを作製し、また、得たハイブリドーマの産生する抗体を用いた競合法によるELISAを確立した。平成10年度は、実施計画に従い、イムノアフィニティーカラムの作製を行った。数種のハイブリドーマの産生するMAbは、何れも同様にcrocetin配糖体に対して広範な交差反応性を示したため、今回は最も活性の高かった1A12を用いた。ハイブリドーマ1A12をマウス腹腔にて培養し、MAbを含んだ腹水を採取した。腹水をプロテインGアフィニティーカラムに付し、MAb 1A12を精製した。精製したMAb 1A12(17mg)の糖部をNalO_4により開環活性化し、ヒドラジンカラムと結合(結合率:99.6%)、イムノアフィニティーカラム(容量=3.5ml)を作製した。Crocetin配糖体(400 μg)をPBSに溶解し、PBSを用い初期化したカラムに付した。4hrペリスタポンプを用いてカラム内を循環(1ml/min)させた。PBSを用いカラムを洗浄した後、各種溶離液を流し溶出率を算出した。その結果、溶離液として100mM acetate buffer(pH4)-0.5 MKSCN-20%MeOHを用いた場合、90%以上溶出することを確認した。 また、キャパシティーはcrocinに対しては 20μg/ml gelであり、crocetin diglucosideに対しては8.4μg/ml gel、crocetin triglucosideに対しては19μg/ml gelであった。本イムノアフィニティーカラムは、crocin代謝産物含有組織エキスの分離精製等、crocinの体内動態研究に応用可能である。