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小型化抗体を活用した高性能Eastern blottingの開発研究

使用小型化抗体进行高性能Eastern blotting的研究和开发

基本信息

批准号：
17750074
负责人：
田中宏幸
金额：
$ 2.3万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

本年度は、Eastern blottingの更なる高機能化を目指し、モノクローナル抗体に代わる新規プローブの開発を行った。新規プローブとしては、抗体の可変領域をフレキシブルなペプチドリンカーで結合した小型化抗体を採用した。薬用人参の成分であるジンセノシドを認識するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマからm-RNAを抽出した後、相補的なDNAを合成した。抗体の可変領域の遺伝子(VH, VL)を増幅するための特異的なプライマーをデザインし、各々の遺伝子を続いて増幅した。増幅した遺伝子のシークエンスを行った結果、マウスのIgGの可変領域に相当する配列を有することを確認し、その配列を基にリンカープライマーを設計した。次に、overlap extension PCRを行い、VH, VL遺伝子を連結することで小型化抗体(scFV)遺伝子を作製した。作製した抗ジンセノシドscFV遺伝子を発現用ベクターpET28(a)に導入した後、これを用いて大腸菌BL21を形質転換した。形質転換したBL21についてIPTG添加によりscFvの発現を確認した結果、分子量30kDaのタンパク質の発現を確認することができた。発現したscFvの活性を確認するために、封入体に発現したscFvの巻き戻しを行った後、ジンセノシドータンパク質コンジュゲートを固相化抗原としたELISAを行った。その結果、抗ジンノセノシドscFVはモノクローナル抗体と同等の反応性を示すことを確認した。続いて、作製した抗ジンノセノシドscFVをプローブとしてEastern blottingを行った結果、ジンセノシド類を検出することに成功した。本研究課題で日的としたメンブレンクロマトグラフィーと新規プローブを採用した高機能化Eastern blottingに世界で初めて成功した。

This year, the Eastern blotting system has been upgraded to a new functional system, and the new system has been developed. The new regulation allows for the use of miniaturized antibodies in different areas. The components of ginseng were extracted and DNA was synthesized. The variable domain of antibodies (VH, VL) increases in amplitude, and the specific domain of antibodies increases in amplitude. The results of the test and the results of the test and the results of the test are as follows: secondary, overlap extension PCR, VH, VL gene linkage, and miniaturized antibody (scFV) gene production After the introduction of pET28(a), the strain was transformed into E. coli BL21. The presence of scFv in BL21 was confirmed by IPTG addition. The presence of scFv in BL21 was confirmed by IPTG addition. The activity of scFv was confirmed by ELISA. The results of the study confirm that the anti-inflammatory scFV is resistant to anti-inflammatory drugs and is equivalent to anti-inflammatory drugs. In the middle of the game, the game was successfully played. This research topic is based on the success of the Eastern blotting.