MALDI TOF-MSによるサブピコモルレベル蛋白質構造機能相関分析

c-src癌遺伝子を発現しているヒト結腸腺癌細胞COLO 320 DMをM期同調化剤としてnocodazole及び,G1/S期同調化剤としてaphidicolinを用いて、各細胞周期に同調化後,各周期の細胞をそれぞれ分画、2次元電気泳動を行い、western immunoblot analysisにより、N-Myr-pp60^<c-src>の細胞内分布を検討した.さらに免疫学的手法及びペパーテクノロジーとMALDITOF-MSを組み合わせた新しい手法を駆使してN-Myr-pp60^<c-src>の分子構造を検討した.その結果、活性型N-Myr-pp60^<c-src>を立体的にかつ特異的に認識できる抗体clone28及びMALDITOF-MSを用いたサブピコモルレベル分析により活性化N-Myr-pp60^<c-src>は、等電点が6.0のタイプのものであった.つまりこの等電点6.0のN-Myr-pp60^<c-src>のTyr527は脱リン酸化を受けていることがわかった.この状態でN-Myr-pp60^<c-src>は,キナーゼ活性を有していることが示唆された. さらに形質膜移行シグナルとしてのミリストイル化を受けた新規生合成N-Myr-pp60^<c-src>は,直ちに細胞質がら膜へと移行した後、M基において再度細胞質に移行することが観察され、このN-Myr-PP60^<c-src>の逆移行には、Heatshock Proteinが関与していることが示唆された.現在、M期におけるN-Myr-pp60^<c-src>の役割について検討中である,

c-src癌遺伝子を発現しているヒト結腸腺癌細胞COLO 320 DMをM期同調化剤としてnocodazole及び,G1/S期同調化剤としてaphidicolinを用いて、各細胞周期に同調化後,各周期の細胞をそれぞれ分画、2次元電気泳動を行い、western immunoblot analysisにより、N-Myr-pp60^<c-src>の細胞内分布を検討した.さらに免疫学的手法及びペパーテクノロジーとMALDITOF-MSを組み合わせた新しい手法を駆使してN-Myr-pp60^<c-src>の分子構造を検討した.その結果、活性型N-Myr-pp60^<c-src>を立体的にかつ特異的に認識できる抗体clone28及びMALDITOF-MSを用いたサブピコモルレベル分析により活性化N-Myr-pp60^<c-src>は、等電点が6.0のタイプのものであった.つまりこの等電点6.0のN-Myr-pp60^<c-src>のTyr527は脱リン酸化を受けていることがわかった.この状態でN-Myr-pp60^<c-src>は,キナーゼ活性を有していることが示唆された. さらに形質膜移行シグナルとしてのミリストイル化を受けた新規生合成N-Myr-pp60^<c-src>は,直ちに細胞質がら膜へと移行した後、M基において再度細胞質に移行することが観察され、このN-Myr-PP60^<c-src>の逆移行には、Heatshock Proteinが関与していることが示唆された.現在、M期におけるN-Myr-pp60^<c-src>の役割について検討中である,