アレルギー初期過程におけるSH2ドメインの細胞内動態の画像解析

过敏早期SH2结构域细胞内动态图像分析

基本信息

批准号：
09771950
负责人：
古野忠秀
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Nagoya City University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至 1998
项目状态：
已结题

项目摘要

アレルギー初期過程におけるSH2ドメインの細胞内動態の画像解析のために、SH2ドメインの中の相同性の高い領域の12残基のアミノ酸に対するモノクローン抗体を作製したところ、ラット好塩基球細胞株(RBL-2H3)の細胞内のSH2ドメインを認識する2種類の抗体(12E,32D)を得た。共焦点レーザ顕微鏡を用いてRBL-2H3細胞の抗原刺激前後でのSH2ドメインの細胞内動態を画像解析したところ、未刺激の細胞では細胞質に均一に分布していた蛍光が、12E抗体では抗原刺激後30秒から2分程度で細胞膜付近に強く分布するようになり、32D抗体では刺激後数分で細胞質内の蛍光が増大し顆粒状に分布する様子が観察された。次に、Western blottingにより抗体が認識している細胞内蛋白質の分子量を調べたところ、12E抗体と32D抗体はともに複数の蛋白質を認識しており、12E抗体は約60kDa、32D抗体は約120kDaの蛋白質を強く認識していた。12E抗体が認識している約60kDaの蛋白質はSrcであると予想されたため、12E抗体で免疫沈降した蛋白質を抗Src抗体でwestern blbttingしたところ、60kDaに特異的なバンドが検出され、12E抗体の認識している蛋白質の一つはSrcであることが分かった。また、12E抗体は神経成長因子によって神経細胞に分化させた副腎髄質褐色細胞腫(PC12)の神経突起を強く染色することが明らかになった。このように、12抗体はアレルギー反応関与する蛋白質だけでなく神経細胞の分化に関与する蛋白質も認識しており、これらの抗SH2抗体を用いるとアレルギー反応に関わる免疫細胞だけでなく神経細胞でも細胞内情報伝達におけるSH2ドメインの機能解析が可能になると期待された。

为了在早期过敏过程中对SH2结构域的细胞内动力学进行图像分析，制备了SH2结构域内高度同源性区域中12个残基的氨基酸的单克隆抗体，并准备了两种类型的抗体（12E，32D），这些抗体（12E，32D）识别basephiL basphile basphile basphile basphile basphilly basphilly cell Line（RAPPHIL Cell Line）的细胞内SH2域（rbl-2H3）。当进行图像分析以分析使用共焦激光显微镜对RBL-2H3细胞进行抗原刺激之前和之后分析SH2结构域的细胞内动力学时，观察到，在未刺激的细胞中，在细胞质中均匀分布的荧光在未刺激的细胞中均匀地分布在附近，在30次的细胞中分布了30次，以至于30次ant胞浆，并在12e antib iNT刺激。用32D抗体刺激后几分钟，细胞质内的荧光增加，并且细胞质内的荧光以颗粒的形式增加。接下来，当我们检查使用蛋白质印迹的抗体识别的细胞内蛋白的分子量时，12E和32D抗体都识别了多种蛋白质，而12E抗体则强烈识别约60 kDa，而32D抗体强烈识别约120 kDa蛋白。由于预测，12E抗体识别的大约60 kDa的蛋白质是SRC，因此用12E抗体对蛋白质免疫沉淀的蛋白质是用抗SRC抗体进行的Western BlbT，这是一种特异性的60 kDa频带，并且发现SRC被SRC识别为蛋白质由12e antbody所识别的一种。还表明，12E抗体强烈染色的肾上腺髓质细胞瘤（PC12）的神经突（PC12）被神经生长因子分化为神经元。因此，12种抗体不仅识别涉及过敏反应的蛋白质，而且识别参与神经元分化的蛋白质，并且可以预期，使用这些抗SH2抗体将允许对SH2结构域的功能分析，不仅在与过敏反应的免疫细胞中，而且在神经元中有关。