人工膜を用いたP450機能の再構築

使用人工膜重建 P450 功能

• 批准号: 09771963
• 负责人: 鈴木 真也
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Oita University of Nursing and Health Sciences (1998)Tohoku University (1997)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 1998
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09771963/
• 关键词: P450; P450還元酵素; リポソーム; 再構成膜; 薬物代謝

ヒトCYP2C9、CYP2C18及びCYP2C19発現酵母を培養し、それらの酵母ミクロソームより各P450タンパクを精製した。またラット肝臓ミクロソームよりP450還元酵素を精製した。次いで、先の中間報告の方法を一部改変し、リポソームを調製した。ジミリストイルホスファチジルコリン、コレステロール(モル比2:1)より小型1枚膜リポソームを作製し、これにデオキシコール酸で可溶化したP450及びP450還元酵素を分子数のモル比25:1:1で混合した。次いで混合液にデオキシコール酸を対脂質モル比0.5となるように添加し、さらにbiobeadsSM2を加えたリン酸緩衝液中で透析して乳白色の澄明なけん濁液を得た。上澄をSepharose CL6Bに処し、void fraction(リポソーム粒子の溶出分画に相当)を回収した。脂質の回収率は70%、CO差スペクトルから算定されるp450の回収率は添加した量の65%、P450還元酵素のそれは30%であった。得られたリポソームの薬物代謝活性を、オメプラゾール5位水産化活性を指標(CYP2C9、CYP2C18、2C19などによって代謝される)に検討した。CYP2C19-リポソームの場合最大活性は1.2nmol/nmol P450/minで再構成系の場合の10.2nmol/nmol P450/minの1/10ほどであった。また、他の分子種では活性は認められなかった。この際、代謝反応中に多量の沈殿が生じていたことから、活性の低さはリポソームの物理的安定性の寄与が大きいのかもしれない。今後、さらにリポソームの形態等検討が必要である。

培养了人CYP2C9，CYP2C18和CYP2C19，并从这些酵母微粒体中纯化每种P450蛋白。另外，从大鼠肝微粒体中纯化了P450还原酶。接下来，对先前的临时报告的方法进行了部分修改以制备脂质体。从二胱氨酰磷脂酰胆碱和胆固醇（摩尔比2：1）中制备了小的单层脂质体，并以25：1：1的摩尔比中混合了用脱氧胆酸溶解的P450和P450还原酶。接下来，将脱氧胆酸添加到混合物中，得出0.5与脂质的摩尔比，然后在含有Biobeadsssm2的磷酸盐缓冲液中透析以获得清晰的乳白色液体。收集上清液遭受sepharose cl6b，并收集空隙（对应于脂质体颗粒的洗脱部分）。脂质回收率为70％，从CO差异频谱中计算出的P450的回收率为增加的量的65％，而P450还原酶的回收率为30％。使用Omeprazole 5位渔业活性作为指数（由CYP2C9代谢，CYP2C18、2C19等）检查所得脂质体的药物代谢活性。 CYP2C19-脂质体的最大活性为1.2 nmol/nmol P450/min，对于重构系统，约为10.2 nmol/nmol P450/min的1/10。此外，在其他分子物种中未观察到活性。目前，在代谢反应期间发生了大量降水，因此低活性可能是对脂质体物理稳定性的主要贡献。将来需要进一步考虑脂质体形态和其他因素。