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人工膜を用いたP450機能の再構築

使用人工膜重建 P450 功能

基本信息

批准号：
09771963
负责人：
鈴木真也
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Oita University of Nursing and Health Sciences (1998)Tohoku University (1997)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至 1998
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09771963/
关键词：
P450 P450還元酵素リポソーム再構成膜薬物代謝

项目摘要

ヒトCYP2C9、CYP2C18及びCYP2C19発現酵母を培養し、それらの酵母ミクロソームより各P450タンパクを精製した。またラット肝臓ミクロソームよりP450還元酵素を精製した。次いで、先の中間報告の方法を一部改変し、リポソームを調製した。ジミリストイルホスファチジルコリン、コレステロール(モル比2:1)より小型1枚膜リポソームを作製し、これにデオキシコール酸で可溶化したP450及びP450還元酵素を分子数のモル比25:1:1で混合した。次いで混合液にデオキシコール酸を対脂質モル比0.5となるように添加し、さらにbiobeadsSM2を加えたリン酸緩衝液中で透析して乳白色の澄明なけん濁液を得た。上澄をSepharose CL6Bに処し、void fraction(リポソーム粒子の溶出分画に相当)を回収した。脂質の回収率は70%、CO差スペクトルから算定されるp450の回収率は添加した量の65%、P450還元酵素のそれは30%であった。得られたリポソームの薬物代謝活性を、オメプラゾール5位水産化活性を指標(CYP2C9、CYP2C18、2C19などによって代謝される)に検討した。CYP2C19-リポソームの場合最大活性は1.2nmol/nmol P450/minで再構成系の場合の10.2nmol/nmol P450/minの1/10ほどであった。また、他の分子種では活性は認められなかった。この際、代謝反応中に多量の沈殿が生じていたことから、活性の低さはリポソームの物理的安定性の寄与が大きいのかもしれない。今後、さらにリポソームの形態等検討が必要である。

CYP2C9, CYP2C18, and CYP2C19-producing yeasts were cultured and purified. The enzyme P450 was purified from the liver. Second, the method of intermediate report is partly changed, and the system is modulated. The ratio of P450 and P450 reducing enzyme molecules to each other is 25:1:1. In the next step, the mixture was added to the acid buffer solution at a ratio of 0.5 to 0.5, and the dialysis solution was obtained by adding biobeadsSM2 to the acid buffer solution. Sepharose CL6B was dissolved and void fraction was recovered. The lipid recovery rate is 70%, the CO difference is 65%, and the P450 enzyme recovery rate is 30%. The metabolic activity of these compounds was evaluated by measuring the aquatic activity at position 5 (CYP2C9, CYP2C18, CYP2C19). CYP2C19-C19-C19 The activity of other molecular species is recognized. In this case, the metabolic reaction in a large amount of water, water, In the future, it is necessary to discuss the form of the system.