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マウスのDNAポリメラーゼα/プライマーゼ複合体を用いたDNA複製開始機構の解明

使用小鼠 DNA 聚合酶 α/引物酶复合物阐明 DNA 复制起始机制

基本信息

批准号：
09780584
负责人：
水野武
金额：
$ 1.28万
依托单位：
The Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至 1998
项目状态：
已结题

项目摘要

真核生物の染色体DNA複製のメカニズムを解明するために、マウスのDNAポリメラーゼα/プライマーゼ複合体(Pol.a)を標的とし、Pol.αの4つのサブユニット(p180,p68,p54,p46)の機能解析に取り組んだ。動物培養細胞を用いたcDNA発現系を用いることでp54のN末端とp180のC末端に核移行シグナルが存在し、サブユニット間の特異的な組合せ、p46とp54、p68とp180、が核への移行に重要であることを見出した。さらに機能不明であったp68がp180の効率的な翻訳に重要であることを見出した。これらのサブユニット間の相互作用をさらに明らかにするために、3つ、或いは4つのサブユニットの同時発現を試みた。ポリオウイルス由来のintemal ribosome entry siteを用いて、複数のcDNAを同時に発現し得る発現プラスミドを構築し、COS-1細胞へ一過性過剰発現させた。その結果、p46はp54を介してpl80に結合すること、p68はp180を介してp46:p54に結合することが明らかになった。さらに、pl80のC末端領域に位置する亜鉛フィンガーモチーフがp68との相互作用に必須であることを見いだした。この亜鉛フィンガーモチーフとp68との相互作用は翻訳中もしくは翻訳直後で生じていることも同時発現により示された。一方、p46:p54もp180のC末端領域(1279-1465アミノ酸)と相互作用することが判明したが、その相互作用には亜鉛フィンガーモチーフは必要ではなく、結合様式が異なることが示された。以上の結果から、p180のC末端を中心とした4つのサブユニットの分子構築に関するモデルを初めて提示することができた。また、Pol.αの生合成過程として、まずpl80が翻訳され、翻訳中或いはその直後にp68が結合し、その後、細胞質中でp46:p54ヘテロダイマーが相互作用することでヘテロテトラマーが形成され、核へ移行するというモデルを提示することができた。

Analysis of DNA replication in eukaryotes and its functional components of the complex (Pol.a) with 4 markers (p180,p68,p54,p46) The cDNA expression system in cultured animal cells is characterized by the presence of specific combinations of p46, p54, p68, p180 and p54 in the N-terminal region of p54 and the C-terminal region of p180. P68 is an important part of the function. The interaction between the two sides of the fence is not only obvious, but also obvious, such as 3, or 4. The expression of multiple cDNAs was constructed simultaneously and the transient expression of COS-1 cells was observed. P46: p54: p68: p46: p54: p68: p68: p69: p68: p6 The position of the C-terminal domain of the pl80 must be determined by the interaction between the pl80 and p68. The interaction between the two groups is not only a matter of time, but also a matter of time. The C-terminal domain (1279-1465) of p46:p54 and p180 interacts with each other. The above results show that the C-terminal of p180 is centered on the molecular structure of p180. The synthesis process of Pol. alpha is characterized by the fact that p68 binds to, and p54 interacts with, the formation and migration of the nucleus.