高等真核生物の複製関連因子の探索とin situ核内再構築

寻找高等真核生物中的复制相关因子和原位核重建

• 批准号: 12206083
• 负责人: 水野 武
• 金额: --
• 依托单位: The Institute of Physical and Chemical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12206083/
• 关键词: α型DNAポリメラーゼ; DNAポリメラーゼα; DNAポリメラーゼδ; プライマーゼ; Cdc45; replication foci; DNAポリメラーゼε; クロマチン

高等真核生物の遺伝子はreplication factoryと呼ばれる核内の構造体に於いて複製される。しかし、複製因子の多くはfactoryに必要な分子以上のスペア分子が核内に散在しており,replication factoryの実体解明の障害となっている。巨大で複雑なゲノム構造を反映させながらDNA複製機構を理解するためには,核内で実際に働いている因子に焦点を絞った解析が必要不可欠である。そこで,DNA複製関連因子の核内での動態をクロマチン分画法により解析した。マウスDNAポリメラーゼα,δ,ε,プライマーゼ,Cdc45に対する特異抗体を作製し,Swiss3T3細胞及びFM3A細胞中の細胞内局在部位を詳細に検討した。DNAポリメラーゼα,δ,ε,プライマーゼ,Cdc45はPCNAやMcmと同様に90%以上が0.1%Triton X-100を含むCSK bufferにより抽出されたが、DNase Iにより可溶化されるクロマチン結合画分に数パーセント存在することを見出した。この画分に含まれる割合は細胞増殖刺激に呼応し、S期で最大になることも判明した。一方、クロマチンとの結合の強さや安定性を検討したところ,Cdc45が安定にクロマチンと結合していたのに対し,DNAポリメラーゼαやプライマーゼはクロマチンから容易に遊離することを見出した。また,プライマーゼを構成する二つのサブユニット,p54とp46は2M NaClにより可溶化されるクロマチン結合画分にも検出され,フリーのプライマーゼヘテロダイマーの局在部位がポリメラーゼαの他のサブユニット,p180とp68を伴うヘテロテトラマーとは異なることが示唆された。以上の結果から,哺乳類細胞のDNA複製を行っているreplication fociの検出系が確立できた。この系を用いて,様々な刺激や環境化での複製反応を検出することで核内の複製を反映した解析が可能となり,現在検討中である。

The cultural heritage of higher eukaryotes 伝 subunit と replication factoryと calls ばれる nuclear <s:1> structures に to <s:1> て to replicate される. More than し か し, replicator の く は factory に な necessary molecules above の ス ペ ア molecular が に scattered within the nuclear し て お り, replication factory の be body to interpret の handicap of と な っ て い る. Huge で complex 雑 な ゲ ノ ム tectonic を reflect さ せ な が ら DNA replication institutions を understand す る た め に は, intranuclear で be interstate に 働 い て い る factor に focus を ground っ た parsing が need not owe で あ る. Youdaoplaceholder0 を で で,DNA replication correlation factor <s:1> nuclear で <s:1> dynamic を を ロ ロ チ チ で dissection method によ によ analysis of た. マ ウ ス DNA ポ リ メ ラ ー ゼ alpha, delta, epsilon, プ ラ イ マ ー ゼ, Cdc45 に す seaborne る し, the specific antibody を cropping Swiss3T3 cells and び FM3A の cells inside bureau in parts detailed に を beg し 検 た. DNA ポ リ メ ラ ー ゼ alpha, delta, epsilon, プ ラ イ マ ー ゼ, Cdc45 は PCNA や Mcm と with others に 90% が を Triton X - 100 containing 0.1% む CSK buffer に よ り spare さ れ た が, DNase I に よ り solubilization さ れ る ク ロ マ チ ン combined with drawing fractal に パ ー セ ン ト exist す る こ と を shows し た. <s:1> the division of に contains まれる, the cleavage is combined, the cell proliferation is stimulated by に, the call is 応, the S phase で is at its maximum, and the になる と と is determined by た. Side, ク ロ マ チ ン と の combined with strong の さ や stability を beg し 検 た と こ ろ, Cdc45 が settle に ク ロ マ チ ン と combining し て い た の に し seaborne, DNA ポ リ メ ラ ー ゼ alpha や プ ラ イ マ ー ゼ は ク ロ マ チ ン か ら easy に free す る こ と を shows し た. Youdaoplaceholder0,プラ and ゼを ゼを make up する two また and サブユニット and サブユニット,p54と and p46 また 2M NaCl に よ り solubilization さ れ る ク ロ マ チ ン combined with draw points に も 検 out さ れ, フ リ ー の プ ラ イ マ ー ゼ ヘ テ ロ ダ イ マ ー の bureau in parts が ポ リ メ ラ ー ゼ alpha の he の サ ブ ユ ニ ッ ト, p180 と p68 を with う ヘ テ ロ テ ト ラ マ ー と は different な る こ と が in stopping さ れ た. The above <s:1> results た ら, mammalian cell <s:1> DNA replication を って る るreplication foci 検 検 lineage が established で た た た. こ の is を with い て, others 々 な stimulus や environmental で の copy the 応 を 検 out す る こ と で nuclear の replication を reflect し た resolution が may と な り, now beg in 検 で あ る.

项目成果

Mizushina,M. et al.: "Dehydroaltenusin, a mammalian DNA polymerase αinhibitor"The Journal of Biological Chemistry. 275・43. 33957-33961 (2000)

Mizushina，M.等人：“脱氢altenusin，一种哺乳动物DNA聚合酶α抑制剂”《生物化学杂志》275・43（2000）。

Izumi,M., et al.: "The human homolog of Saccharomyces cerevisiae Mcm10 interacts with replication factors and dissociates from nuclease-resistant nuclear structures in G (2) phase"Nucleic Acids Research. 28・23. 4769-4777 (2000)

Izumi, M., 等人：“酿酒酵母 Mcm10 的人类同源物与复制因子相互作用并在 G (2) 期与核酸酶抗性核结构分离”《核酸研究》28·23 (2000)。