大腸癌モデルマウスを用いた遺伝子治療の基礎実験

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APC遺伝子のexon 1から14までの約2キロベースをmRNAからRT PCRで増幅する。正常マウスの腸管からIso-gen kitを用いてmRNAを抽出し、逆転写酵素でcDNAを作製する。exon 1から14に特異的な塩基配列にSubcloningしやすい様に制限酵素のsiteを付加したPCRプライマーを作成し、GeneAmp Kitを用いてPCRを行ない正常マウスAPC遺伝子exon 1〜14を増幅する。pCMV-Flag Plasmid にレポーター遺伝子Flag 蛋白とAPC遺伝子が接合するようにSubcloningする。同時にexon 15に特異的なPCRプライマーを作成し、exon 15を増幅し、上記のPlasmidに結合し、APC遺伝子8535ベース全長を構築する。Adeno Virus Expression kitを用いて、Flag-APC遺伝子をコスミドベクターに導入する。Cre遺伝子を組み込んだコスミドベクターと制限酵素処理済みDNA-TPCとを293細胞にco-transfectにより導入し、相同組換えを起こし非増殖型の組換えアデノウイルスを得る。現在、再考を加えつつ導入遺伝子を作製中である。