アルカリフォスファテース遺伝子導入による培養歯髄細胞の硬組織形成能

碱性磷酸酶基因导入培养牙髓细胞的硬组织形成能力

• 批准号: 10771050
• 负责人: 大原 直子
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Nagasaki University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 1999
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-10771050/
• 关键词: 歯髄細胞; アルカリフォスファテース; GFP; 遺伝子組換え; 石灰化; アルカリファスファテース

1、アルカリフォスファテース発現量と硬組織形成能に関する検討抜去したヒト健全歯の歯髄組織から遊走した歯髄細胞を継代培養した。アルカリフォスファテース活性を測定したところ、検出限界程度の低活性値を示した。そこで、アルカリフォスファテース高発現性のヒト骨肉腫細胞株(NOS-1)を入手し、硬組織形成能の比較検討を行なった。培地にグリセロリン酸カルシウムを添加し硬組織形成誘導を行なったところ、NOS-1のみに細胞の層状化がみられ石灰化組織を観察できた。アルカリフォスファテースの発現量は硬組織形成能に大きく影響することが明らかとなった。2、アルカリフォスファテース遺伝子のクローニングとベクター作製NOS-1細胞を破砕後、オリゴdTカラムによりmRNAを抽出した。また、データベース登録配列をもとに臓器非特異型のアルカリフォスファテースに対するPCRプライマーを設計しRT-PCRを行ない、アルカリフォスファテース遺伝子のクローニングに成功した。またこの遺伝子断片を発現ベクター(pEGFP-N1)に挿入し、グリーンフルオレッセントプロテイン(GFP)とアルカリフォスファテースの融合融蛋白質をを発現可能なベクターを作製した。3、培養歯髄細胞の形質転換遺伝子の導入効率がよく、in vivoへも応用可能なエレクトロポーレーション法の可能性を検討した。歯髄細胞を培養皿でほぼコンフルエントになるまで培養し、皿電極にてエレクトロポーレーションを行った。GFPの発現にて遺伝子の導入を確認し、ネオマイシン耐性の形質転換細胞を選択した。現在、形質転換細胞の硬組織形成能については確認中である。本研究から、細胞移植という、直接覆髄、生活断髄後の修復被蓋象牙質形成に関して新しい概念にもとづく治療法に発展させることの可能性が示唆された。

1. The development of hard tissue is related to the development of healthy dental tissue. The activity of the enzyme is determined by measuring the activity level of the enzyme and the activity level of the enzyme. A comparative study of the ability of osteoma cells (NOS-1) to form hard tissues was carried out. The formation of hard tissue was observed in the cells of NOS-1. The amount of hard tissue formation can be greatly affected by the development of hard tissue. 2. The expression of mRNA in NOS-1 cells was detected by PCR. In addition, the RT-PCR system was successfully designed for the purpose of identifying and identifying the specific types of PCR products. The fusion protein of this gene fragment (pEGFP-N1) can be produced by fusion protein (GFP) and fusion protein (GFP). 3. To investigate the possibility of introducing DNA into cultured dental cells by in vivo and in vitro methods. The cells were cultured in a dish and the cells were cultured in a dish. GFP gene expression was confirmed by gene introduction, and the selection of morphologically altered cells was performed. Now, physical and qualitative change of cells and hard tissue formation can be confirmed. This study demonstrates the possibility of developing new concepts and therapies related to cell transplantation, direct transplantation, and dentin formation after life interruption.