白血球の機能発現におけるコフィリンの役割に関するアンチセンス法による解析

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本研究は、細胞骨格制御タンパク質であるコフィリンについてアンチセンスオリゴDNAの標的となるmRNA上の配列を確定し、コフィリン量を減少させた細胞を用いて白血球機能発現におけるコフィリンの役割を解析することを目的とする。前年度においては、アンチセンス配列及び細胞への投与方法の検討を行った。mRNAの翻訳開始コドンを含む領域4種類、有効配列のコンピューター予測から5種類のオリゴDNA(ホスホロチオエート修飾型)を用意した。細胞への導入率の検討のため蛍光標識したものも用意した。細胞は、マクロファージ様に分化誘導したU-937細胞など、ヒト由来の白血球系細胞を用いた。細胞への投与は、高濃度(10μM程度)のオリゴDNA単独で、あるいは低濃度(1μM程度)のオリゴDNAと少量の遺伝子導入試薬を併用して行った。蛍光標識したオリゴDNAを投与した細胞を共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡で観察したところ、オリゴDNAが細胞内に取り込まれていることが確認され、また、遺伝子導入試薬を併用した場合の方が細胞への導入効率がよいことが示された。今年度は、アンチセンス配列について、前年度の予備的な結果を踏まえてさらに検討し、翻訳開始コドンを含む領域(20塩基)に対する配列が有効であるという結果が得られた。また、ヒト由来の細胞のみでなくマウス由来のJ774.1細胞(マクロファージ様)においても、同領域に対する配列が有効であることが示され、コフィリンのアンチセンス領域を確定することができた。