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未知のヒト膵液中の抗菌活性ペプチドの精製と解析

人胰液中未知抗菌活性肽的纯化及分析

基本信息

批准号：
10771349
负责人：
菊池賢
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Tokyo Women's Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至 1999
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-10771349/
关键词：
膵液抗菌活性耐熱性ペプチド塩基性ペプチド

项目摘要

膵液のゲル濾過抗菌活性分画を更に精製するため、効率の良い活性測定法の検討を行なった。defensinのbioassay系であるradial diffusion assay法を改良したところ、培地のpH8.8、指示菌にE.coli Kpを用いた条件が最も感度に優れ、殺菌曲線で活性の認められたゲル濾過分画の活性を測定できた。この系による塩基性抗菌ペプチドpolymyxin Bの測定限界値は1μg/mlと優れていた。最も活性の高いゲル濾過分画はpolymyxin B換算でほぼ100μg/mlに相当する抗菌力を示していた。この抗菌活性は65度20分、95度20分処理でも全く失活せず、むしろ95度20分では活性の上昇が認められた。この抗菌活性は2.5M NaCl存在下でも認めらるため、生化学的性状の近いと思われるlactoferricin B,lactoferricin Hなどの抗菌ペプチドとは異なるものと考えられた。紫外吸収スペクトルではOD220付近に最大の吸収域とOD280に別なピークがあり、ペプチドによるものと思われた。Tricine-SDS-PAGEで分画を試みたところ、分子量3000以下と考えられた。ゲル濾過分画を更に、イオン交換HPLCにて精製したところ、予想に反して陽イオン交換HPLCでは全くカラムに吸着されず、陰イオン交換(DEAE)HPLCで幾つかのピークに分離された。このうち抗菌活性は複数の分画に分かれて存在したため、単一の物質ではないものと考えられた。実際、抗菌活性の強いゲル濾過分画をradial diffusion assay法でbioassayすると、double zone現象が認められることから、少なくとも活性物質は2種類以上ある可能性が高い。

A study on the purification and determination of the antibacterial activity of the filtrate Defensin bioassay system was improved by the method of radial diffusion assay, pH 8.8 of culture medium, E.coli Kp of indicator bacteria, and the optimum conditions for sensitivity and activity of defensin bioassay were determined by the method of Yangwei curve. The limit value for the determination of polymyxin B is 1μg/ml. The highest activity of the filter is shown in the polyxin B conversion to 100μg/ml. The antibacterial activity was inactivated at 65 ℃ for 20 min and at 95 ℃ for 20 min. In the presence of 2.5M NaCl, the antibacterial activity of lactoferricin B,lactoferricin H and its biochemical properties were studied. UV absorption range is OD220, maximum absorption range is OD280, maximum absorption range is OD 28 Tricine-SDS-PAGE analysis of molecular weights below 3000 The purification and separation of the product by filtration chromatography and DEAE HPLC are expected to be completed by adsorption and DEAE HPLC. The antibacterial activity of the compound is different from that of the compound. In fact, the strong antibacterial activity is highly probable by the radial diffusion assay, the bioassay, and the double zone phenomenon.