AFMを使った運動タンパク質ミオシンのATP依存性構造変化解析

使用 AFM 分析运动蛋白肌球蛋白的 ATP 依赖性结构变化

• 批准号: 10780405
• 负责人: 齋藤 究
• 金额: $ 0.45万
• 依托单位: Kanazawa University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 1999
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-10780405/
• 关键词: 近接場; エバネッセント照明; G3-ATP; アクトミオシン; AFM; 蛍光イメージング; モータータンパク質

モータータンパク質ミオシンの化学・力学エネルギー変換メカニズムを解明するため、化学反応(ATP加水分解反応)に共役した構造変化をミオシン1分子で同時に計測することを目的として研究を行った。対物レンズ型のエバネッセント場照明顕微鏡を構築した。蛍光性ATPアナログCy3-ATPを使った化学反応を可視化するため、また、Cy3で標識してミオシン1分子を可視化するために励起には半導体レーザー励起のNb:YAGレーザーを使用した。同じレーザーで蛍光色素BODIPYFLで標識したアクチンフィラメントも観察する。Cy3とBODIPY FLの蛍光はダイクロイックミラーで分離し同じ観察が可能な光学系とした。この顕微鏡を使うことによりCy3-ATPを使った1分子ATP加水分解反応の可視化が可能となった。その確認のため、ミオシンと同じモーター蛋白質分子であるATP合成酵素F1による1分子ATP加水分解反応可視化を行った。ミオシン分子をガラス表面に固定する方法の改良を行った。ミオシンの化学反応と力学反応を同時に観察するためにはミオシンの活性を失わずにガラス表面に固定しなければならない。従来は洗浄のみのガラス表面か、化学的に疎水処理されたガラス表面にミオシン分子を固定していたので、活性が失われる場合が多かった。これはガラス表面と蛋白質分子が直接相互作用することによる。そこで、本研究ではガラス表面にアガロースをスピンコートし、その表面に蛋白質分子を固定とした。この固定方法では蛋白質分子の活性は保たれたままであった。蛋白質1分子とアクチンフィラメントを同時に観察する光学系が構築でき、蛋白質分子をガラス基板に固定する方法も開発することができた。この技術とAFMを組み合わせ、今後は化学反応中の構造変化を計測していく。

モ ー タ ー タ ン パ ク qualitative ミ オ シ ン の chemical, mechanical エ ネ ル ギ ー variations in メ カ ニ ズ ム を interpret す る た め, chemical 応 (ATP hydrolysis the 応) に existing し た structure - the を ミ オ シ ン 1 molecular で す に meter test at the same time る こ と を purpose と し を line っ て research た. For object レ ズ ズ type <s:1> エバネッセ ト ト field illumination 顕 micromirror を construction <s:1> た. 蛍 optical ATP ア ナ ロ グ Cy3 - ATP を make っ た chemical anti 応 を visualization す る た め, ま た, Cy3 で logo し て ミ オ シ ン 1 molecular を visualization す る た め に wound up に は semiconductor レ ー ザ ー wound up の Nb: YAG レ ー ザ ー を use し た. With じ レ ー ザ ー で 蛍 photopigment BODIPYFL で logo し た ア ク チ ン フ ィ ラ メ ン ト も 観 examine す る. Cy3 と BODIPY FL の 蛍 light は ダ イ ク ロ イ ッ ク ミ ラ ー し で separation with じ 観 examine が may な optics と し た. こ の 顕 micromirror を make う こ と に よ り Cy3 - ATP を make っ た 1 molecule ATP hydrolysis anti 応 の visualization が may と な っ た. そ の confirm の た め, ミ オ シ ン と with じ モ ー タ ー protein molecules で あ る ATP synthetase F1 に よ る 1 molecule ATP hydrolysis line against 応 visualization を っ た. The に fixation する method of をガラス molecular をガラス surface に modification を line った. ミ オ シ ン の chemical anti 応 と mechanics inverse 応 を simultaneously に 観 examine す る た め に は ミ オ シ ン の active を lost わ ず に ガ ラ ス surface に fixed し な け れ ば な ら な い. 従 incorporated to は の み の ガ ラ か ス surface, chemical に 疎 water 処 Richard さ れ た ガ ラ ス surface に ミ オ シ ン molecular を fixed し て い た の で, active が lost わ れ が る occasion more か っ た. The と protein molecules on the surface of が interact directly with する とによる とによる とによる とによる ガラス. そ こ で, this study で は ガ ラ ス surface に ア ガ ロ ー ス を ス ピ ン コ ー ト し, そ に の surface protein molecules を fixed と し た. <s:1> <s:1> fixation method で <s:1> protein molecule <s:1> activity <e:1> preservation たれたままであった. Protein molecules 1 と ア ク チ ン フ ィ ラ メ ン ト を also に 観 examine す る optics が build で き, protein molecules を ガ ラ ス substrate に fixed す る method も open 発 す る こ と が で き た. The <s:1> <s:1> technology とAFMを is combined with み わせ, and in the future, the <s:1> structural change を measurement in the <s:1> chemical reaction 応 is て て く く く く.

项目成果

齋藤究: "アンチストークス蛍光を用いた多色蛍光顕微鏡法"生物物理. 39. 316-318 (1999)

Satoshi Saito：“使用反斯托克斯荧光的多色荧光显微镜”生物物理学 39. 316-318 (1999)。

齋藤究: "近接場光学の原理と生物科学への応用"蛋白質核酸酵素. 44. 807-811 (1999)

Satoshi Saito：“近场光学原理及其在生物科学中的应用”蛋白质核酸酶 44. 807-811 (1999)

齋藤究・船津高志: "近接場光学の原理と生物科学への応用" 蛋白質核酸酵素. (印刷中).

Satoru Saito 和 Takashi Funatsu：“近场光学原理及其在生物科学中的应用”蛋白质核酸酶（正在出版）。