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脂質二重膜中の埋め込まれた蛋白質1分子のエバネッセント場照明によるイメージング

使用倏逝场照明对嵌入脂质双层中的单个蛋白质分子进行成像

基本信息

批准号：
11122206
负责人：
齋藤究
金额：
$ 1.47万
依托单位：
Kanazawa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11122206/
关键词：
近接場エバネッセント照明 ATP合成酵素 F1 Gy3-ATP

项目摘要

本研究では、ATPの化学エネルギーを回転運動という力学エネルギーに変換しているATP合成酵素F1を研究対象としている。蛍光性ATPアナログCy3-ATPを使った1分子化学反応と、蛍光標識アクチンフィラメントを指標としたF1の回転運動を同時に観察することで、膜蛋白質F1の化学力学反応の詳細な機能解析を目標とした。脂質二重膜に埋め込まれた蛋白質1分子を観察するために対物レンズ型のエバネッセント場照明顕微鏡を構築した。化学反応を可視化するためのCy3と回転運動を観察するためのBODIPY F1の両方の蛍光色素を同時観察できる顕微鏡にした。F1の回転観察では、ガラス表面に対するF1の固定方法を改良した。F1にはHis-Tagを遺伝子工学の手法で導入してある。従来、ガラス表面に非特異的に吸着させたNiNTA-ペロオキシターゼにHis-F1を吸着させていたが、本研究ではNiNTAをBSAに結合させ、NiNTA-BSAをガラス表面に吸着させることでF1をガラス表面に固定した。この方法でも従来の方法と同様にF1の回転運動が観察され、F1が発生するトルクの大きさも同様であった。次にNiNTA-BSAを介してガラス表面に固定したF1によるCy3-ATP1分子加水分解反応の画像化を行った。F1の存在する場所ではCy3-ATPの蛍光による輝点の点滅が観察された。これは、Cy3-ATPがF1に結合、F1により加水分解された後、Cy3-ADPとしてF1から解離していくことを意味している。本年度までの研究でF1の回転運動とATP加水分解反応を1分子レベルで観察する環境が整った。今後は、両者を同時に観察することにより化学力学反応のカップリングを詳細に検討する。さらにF1を脂質二重膜に埋め込み同様の解析を行う。

In this study, ATP synthase F1 is the subject of research on the transformation of ATP's chemical and mechanical elements. The aim of this study is to analyze the molecular chemical reaction and the photochemical reaction of membrane protein F1. Lipid double membrane, protein 1 molecule, fluorescence microscope, fluorescence microscope Chemical reaction visualization of Cy3 and cyclic motion observation of BODIPY F1 and simultaneous observation of fluorescent pigments The fixing method of F1 is improved when the surface of F1 is fixed. F1 is the introduction of His-Tag technology. In this study, NiNTA-BSA was bound to NiNTA-BSA by non-specific adsorption on NiNTA-BSA surface. This method is similar to the method used to detect the return motion of F1 and the method used to generate F1. Next, NiNTA-BSA was used to immobilize F1 on the surface of the glass to visualize the hydrolysis reaction of Cy3-ATP1 molecules. The existence of F1 is detected in the light of Cy3-ATP. Cy3-ATP is bound to F1, F1 is hydrolyzed, and Cy3-ADP is dissociated from F1. This year's study examined the effects of F1 cycling, ATP hydrolysis, and molecular degradation on environmental integrity. In the future, the chemical and mechanical reactions will be discussed in detail. F1 is a lipid double membrane.