マイクロボディに局在する低分子量熱ショック蛋白質ホモログHSP27の構造と機能

微体中低分子量热休克蛋白同源物 HSP27 的结构和功能

• 批准号: 11740439
• 负责人: 加藤 朗
• 金额: $ 1.47万
• 依托单位: Niigata University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 2000
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-11740439/
• 关键词: マイクロボディ; sHSP; シロイヌナズナ; ペルオキシソーム; PTS2

トマトホモログ遺伝子の単離と発現解析今年度はシロイヌナズナHSP27の相同クローンとして,トマト緑葉からLeMP26cDNAを単離し,その一次構造を明らかにし,さらに遺伝子発現パターンの解析を行った。単離したLeMP26cDNAから予想されるポリペプチドは238アミノ酸からなり,C末端側には低分子量熱ショックタンパク質に共通する保存配列(α-クリスタリンドメイン)が,N末端にはペルオキシソームへの輸送シグナルであるPTS2配列との相同配列が見い出された。また,25℃で育成したトマト緑葉に38℃の熱ショックを与え,熱ショック後のLeMP26mRNAの変動をRT-PCRで検討した。その結果,緑葉では既にmRNAの蓄積が観察されること,熱ショックによって急激にmRNA量が減少し,その後,時間の経過とともに発現量が回復することが明らかになった。これは,LeMP26が熱ショック応答遺伝子ではないことを示している。組換えHSP27タンパク質を用いた機能解析シロイヌナズナHSP27の組換えタンパク質を大腸菌で合成,精製し,in vitroにおける機能と分子構造の解析を試みた。しかし,成熟型HSP27タンパク質を大腸菌で合成することはできなかった。そこで,他の低分子量熱ショックタンパク質とのホモロジーが低いN末端側102アミノ酸を切除し,α-クリスタリンドメインを含むC末端側147アミノ酸のみからなる組換えタンパク質(ΔN-HSP27)を合成した。精製したΔN-HSP27の分子量をショ糖密度勾配遠心法によって推定したところ,約21kDであった。従ってΔN-HSP27は,溶液中ではモノマーとして存在すると考えられる。また精製標品のシャペロン活性を測定したが,タンパク質の熱変成を阻害する活性,変成タンパク質のrefoldingを促進する活性,いずれも検出されなかった。切除した領域の機能は全く不明であるので,今後は真核細胞発現系を使用して全長HSP27の合成を行い,改めて活性測定を行う予定である。

This year, the same gene as HSP27 was isolated from the cDNA of LeMP26, and the primary structure of HSP27 was analyzed. The LeMP26 cDNA fragment is expected to contain a wide range of amino acid residues at 238 amino acid residues, a low molecular weight amino acid residue at the C-terminal side, and a PTS2 residue at the N-terminal side. The expression of LeMP26 mRNA was detected by RT-PCR at 25 ℃ and 38℃. As a result, the accumulation of mRNA in green leaves was detected, and the amount of mRNA in hot leaves was decreased. After that, the amount of mRNA in green leaves was recovered after the lapse of time. The LeMP26 is a very hot, very hot. HSP27 is composed, purified, and used in vitro for functional and molecular analysis. Mature HSP27 is synthesized by Escherichia coli. In this case, his low-molecular-weight heat transfer compound (ΔN-HSP27) was synthesized by removing the 102-amino acid on the low N-terminal side, and the α-heat transfer compound (ΔN-HSP27) was synthesized by removing the 147-amino acid on the C-terminal side. The molecular weight of ΔN-HSP27 was estimated to be about 21kD. The existence of ΔN-HSP27 in the solution is examined. To determine the activity of the refined standard, to determine the activity of the heat resistance of the substance, to The function of the excision domain is completely unknown. In the future, the synthesis of full-length HSP27 in eukaryotic development system will be used, and the activity determination will be determined.