核に局在するアクチンファミリーAct3p/ARP4の機能と制御メカニズム

肌动蛋白家族Act3p/ARP4的功能及细胞核调控机制

基本信息

批准号：
11760051
负责人：
原田昌彦
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2000
项目状态：
已结题

项目摘要

出芽酵母にはAct3p/ARP4の他に9種のアクチン関連タンパク質が存在するが、これらの細胞内局在性を調べる目的で、これらのアクチン関連タンパク質をGFPとの融合タンパク質として細胞内で発現し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、Act3p/ARP4の他に、Arps5p,6p,7p,8p,9pが核内局在性を示すことが確認された。これらのアクチン関連タンパク質の核排出シグナル(NES)をアクチンのNESと比較したところ、核に局在するメンバーのNESは保存性が低いことが示され、アクチンファミリーの細胞内局在性におけるNESの重要性が示唆された。出芽酵母のアクチン関連タンパク質であるAct3p/ARP4をGSTとの融合タンパク質として大腸菌で発現・精製し、in vitroで再構成したヌクレオソームに対する結合性をゲルシフトアッセイにより調べたところ、Act3p/ARP4がヌクレオソームに結合することが示された。また、Act3p/ARP4に対する抗体を用いてChromatin Immunoprecipitation assayを行い、his4-912δプロモーター領域に対するAct3p/ARP4のin vitroでの結合を確認した。出芽酵母の核に局在するArp6pのヒトおよびニワトリのホモログと予想されるアクチン関連タンパク質をクローニングし、それぞれhArp6,gArp6と名付けた。その一次構造を決定したところ、ショウジョウバエのヘテロクロマチンに局在することが報告されていたアクチン関連タンパク質と相同性が高いことが見い出され、これらが核内でヘテロクロマチンの形成に関与している可能性が考えられた。gArp6は胚発生の初期に特に発現が高く、胚発生の過程で重要な役割を果たしている可能性が示唆された。

除ACT3P/ARP4外，在萌芽的酵母中还存在9种与肌动蛋白相关的蛋白，并研究其亚细胞定位，这些与肌动蛋白相关的蛋白在细胞中以具有GFP的融合蛋白表示，并在荧光显微镜下观察到。结果，已经证实，除了ACT3P/ARP4，ARPS5P，6P，7P，8P和9P外，还表现出核定位。比较这些肌动蛋白相关蛋白与肌动蛋白NES的核排泄信号（NES）表明，NES（位于原子核的成员）不保守，这表明NES在肌动蛋白家族的亚细胞定位中的重要性。 ACT3P/ARP4是一种来自萌芽酵母的肌动蛋白相关的蛋白，在大肠杆菌中表达并纯化为具有GST的融合蛋白，并且通过凝胶转移测定法检查了在体外重构的核小体与核小体的结合特性，表明ACT3P/ARP4与核糖体结合。另外，使用针对ACT3P/ARP4的抗体进行染色质免疫沉淀测定，并确认ACT3P/ARP4与HIS4-912δ启动子区域的体外结合。克隆了局部植入酵母核的ARP6P的人和鸡肉同源物，分别指定了肌动蛋白相关的蛋白，分别指定了HARP6和GARP6。当确定其主要结构时，发现它与据报道与果蝇异染色质局部的蛋白质相关蛋白高度同源，并且认为这些蛋白可能与核中异染料的形成有关。 GARP6在胚胎发育的早期阶段特别表达，这表明它可能在胚胎发育过程中起重要作用。