出芽酵母の生育に必須な新規アクチン関連タンパク質Act3pの細胞内機能の解析

Act3p（一种酿酒酵母生长必需的新型肌动蛋白相关蛋白）的细胞内功能分析

基本信息

批准号：
07760070
负责人：
原田昌彦
金额：
$ 0.58万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

Act3pに特異性が高く,通常のアクチンや他のアクチン関連タンパク質には反応しない抗体を得るため,Act3pに特異的な挿入アミノ酸配列をコードするACT3遺伝子部分を“QIAexpresssystem"に導入することにより、ヒスチジンのタグ部分を含む融合タンパク質遺伝子をプラスミド上に構築した。このプラスミドを導入した大腸菌を大量培養することにより,Act3p融合タンパク質を得た.この融合タンパク質をNi-NATカラムを用いて精製し,これを兎に免疫することにより,Act3pに特異的に結合するポリクローナル抗体を作製した.この抗体を用い,酵母の抽出液に対してウエスタンブロットを行ったところ,Act3pはSDS-PAGEにおいて55kDaのタンパク質として検出された.これは,アミノ酸配列から予想される分子量54.8kDaに非常に近い値である.固定した出芽酵母の細胞壁を酵素的に溶解してスフェロプラスト化した後,スライドグラス上で螢光抗体法を行なった.螢光顕微鏡下でAct3pの細胞内局在性を観察し,DAPIによる核の染色と比較したところ,大部分のAct3pが核に存在しいることが示された.このAct3pの核への局在は,酵母から単離した核を用いたウエスタンブロットによっても示された.さらに,酵母からの単離核を,0.5MNaClあるいはDNaselで処理することによりAct3pが核から可溶化することがウエスタンブロットにより示された.これはAct3pが核内でクロマチンに結合して存在していることを示唆しており,Act3pが酵母の生育に必須であることと考え合わせ,Act3pが核内でクロマチンの構築において重要な機能を有している可能性がある.今後,Act3pと相互作用する分子の同定・解析が必要であると考えている。

为了获得对ACT3P高度特异性并且不与正常肌动蛋白或其他与肌动蛋白相关的蛋白反应的抗体，通过将ACT3基因部分引入ACT3基因部分，该基因构建了包含组氨酸标记部分的融合蛋白基因，该部分将插入氨基酸序列编码针对ACT3P的插入氨基酸序列，以ACT3P的特异ACT3P融合蛋白是通过培养大量大肠杆菌（用这种质粒引入的）获得的，并通过在兔子上进行免疫，这是一种专门结合与Act3p的多克隆抗体。使用这种抗体，在酵母提取物上进行了蛋白质印迹，并在SDS-PAGE中检测到ACT3P为55 kDa蛋白。该值非常接近从氨基酸序列预测的54.8 kDa的分子量。在固定式上酵母的细胞壁的酶促裂解后，将固定化脱落酵母的细胞壁酶裂解并呈塑料，然后在幻灯片玻璃上进行荧光抗体。在荧光显微镜下观察到ACT3P的亚细胞定位。与API的核染色相比，显示大多数ACT3P都存在于核中。 ACT3P在核中的定位也通过使用从酵母中分离的核蛋白质印迹显示。此外，蛋白质印迹表明，通过用0.5m的NaCl或dnasel从酵母中处理分离的核来从细胞核中溶解ACT3P。这表明ACT3P存在于核中的染色质中，并且认为ACT3P对于酵母生长至关重要，并且ACT3P可能在核中染色质的构造中具有重要功能。我们认为，有必要识别和分析将来与ACT3P相互作用的分子。