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出芽酵母の生育に必須な新規アクチン関連タンパク質Act3pの細胞内機能の解析

Act3p（一种酿酒酵母生长必需的新型肌动蛋白相关蛋白）的细胞内功能分析

基本信息

批准号：
07760070
负责人：
原田昌彦
金额：
$ 0.58万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

Act3pに特異性が高く,通常のアクチンや他のアクチン関連タンパク質には反応しない抗体を得るため,Act3pに特異的な挿入アミノ酸配列をコードするACT3遺伝子部分を“QIAexpresssystem"に導入することにより、ヒスチジンのタグ部分を含む融合タンパク質遺伝子をプラスミド上に構築した。このプラスミドを導入した大腸菌を大量培養することにより,Act3p融合タンパク質を得た.この融合タンパク質をNi-NATカラムを用いて精製し,これを兎に免疫することにより,Act3pに特異的に結合するポリクローナル抗体を作製した.この抗体を用い,酵母の抽出液に対してウエスタンブロットを行ったところ,Act3pはSDS-PAGEにおいて55kDaのタンパク質として検出された.これは,アミノ酸配列から予想される分子量54.8kDaに非常に近い値である.固定した出芽酵母の細胞壁を酵素的に溶解してスフェロプラスト化した後,スライドグラス上で螢光抗体法を行なった.螢光顕微鏡下でAct3pの細胞内局在性を観察し,DAPIによる核の染色と比較したところ,大部分のAct3pが核に存在しいることが示された.このAct3pの核への局在は,酵母から単離した核を用いたウエスタンブロットによっても示された.さらに,酵母からの単離核を,0.5MNaClあるいはDNaselで処理することによりAct3pが核から可溶化することがウエスタンブロットにより示された.これはAct3pが核内でクロマチンに結合して存在していることを示唆しており,Act3pが酵母の生育に必須であることと考え合わせ,Act3pが核内でクロマチンの構築において重要な機能を有している可能性がある.今後,Act3pと相互作用する分子の同定・解析が必要であると考えている。

Act3p has a high degree of sexual specificity, usually with the help of other drugs. The anti-virus antibody has been detected. The anti-virus antibody has been detected in the Act3p virus. In the sub-section, the "QIAexpresssystem" has been inserted into the sub-section of the "QIAexpresssystem" gene, which contains the fusion virus and the fusion virus. A large number of bacteria were cultured in large quantities, and the fusion of Act3p was successful. The fusion virus was used in the treatment of Ni-NAT virus, and the immune system was used to immunize the virus. The combination of the antibody and the antibody of Act3p virus was used. The antibody was used, the yeast extract fluid was extracted from the yeast, and the Act3p SDS-PAGE was extracted. The 55kDa antibody was extracted, and the yeast extract was extracted from the yeast. The molecular weight of 54.8kDa is very close to that of acid. After the immobilization of the cell wall enzyme of Saccharomyces cerevisiae, the cell wall enzyme was digested, and then the photoantibody method was applied. Under the light microscope, the intracellular sex of Act3p was observed, the staining of DAPI nucleus was compared with that of Act3p nucleus, and most of the nuclei were present. The core of the Act3p is located, and the yeast is isolated from the nucleus. Yeast is isolated from the nucleus, 0.5MNaCl is isolated from the nucleus, Act3p is soluble, Act3p is soluble, and the yeast is isolated from the nucleus. In the Act3p, there is a mutation in the nucleus that indicates that there is an instigation, and that the birth of the Act3p yeast must be tested. The possibility that the important machinery of the Act3p may be affected. From now on, Act3p interacting molecules will be analyzed in the same way as necessary.