酵母Three-Hybridシステムによる植物ホルモン受容体のクローニング

利用酵母三杂交系统克隆植物激素受体

• 批准号: 11760093
• 负责人: 水谷 正治
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 2000
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-11760093/
• 关键词: Three-hybrid; 植物ホルモン; スクリーニング; 受容体; オーキシン; オーキシン輸送阻害; 3ハイブリッド; 2ハイブリッド

酵母Three-hybrid法は、低分子リガンド(bait)とタンパク質の相互作用を酵母細胞内で検出し、リガンド受容体候補遺伝子をcDNAライブラリーから直接クローニングする方法である。本研究では、baitとして用いるオーキシンリガンドの合成とその生理活性の検討を行った。またスクリーニングの感度を向上させる目的でThree-hybrid法の改良を試みた。1)オーキシンリガンドの合成と生理活性;まずデキサメタソン(Dex)との架橋を目的とし、NAAの構造活性相関を化合物のオーキシン活性をシロイヌナズナの根の伸長阻害試験により評価した。NAAのアセトキシメチルエステル誘導体は生体内で速やかに加水分解されるためNAAと同等の活性を持つこと、一方NAAのメチルエステルはIC_<50>にしてNAAの約1/6に低下することから、活性にはカルボキシル基が重要であることが判った。そこでNAAを基本骨格として側鎖メチレン基から炭素鎖を伸ばしてDexと架橋可能な官能基を導入した化合物を合成した。そのメチルエステル体は最終濃度10^<-4>Mで顕著に根の伸長を阻害し、10^<-5>Mでは根の重力応答に異常を与えたことから、低濃度ではオーキシンとしてよりもむしろオーキシン輸送の阻害剤として作用している可能性が示唆された。一方、その加水分解物は10^<-5>Mで顕著に根の伸長を阻害し強いオーキシン活性を示した。今後、この化合物を元にオーキシンリガンド創製を目指す。2)酵母Three-hybrid法の改良;スクリーニング感度の向上を目的とし、グルココルチコイド受容体とDexとの相互作用よりもさらに強固なNi-NTAとHis-tag相互作用をThree-hybrid法に応用した新しいスクリーニング法の構築を試みた。Dexとニトリロ三酢酸(NTA)を架橋した複合体(Dex-NTA)およびその細胞膜透過性を向上させたアセトキシメチルエステル誘導体を合成した。His-tagを付加したGAL4-BDおよびGAL4-ADとグルココルチコイド受容体との融合タンパク質を発現させた酵母をリガンド添加培地上で培養したが、リガンドに依存したレポーター遺伝子の転写活性化は検出されなかった。現在リガンドの構造、スペーサーの長さも含めてレポーター遺伝子の転写活性化が起こる条件を引き続き検討している。

Yeast Three-hybrid method is a method for detecting and identifying receptor candidate genes in yeast cells by low molecular weight bait and protein interactions. In this study, we investigated the physiological activity of bait-containing compounds. An improved Three-hybrid method is proposed to improve the sensitivity of the Three-hybrid method. 1) Synthesis and physiological activity of NAA; structure and activity of NAA; structure and activity of NAA related compounds; elongation and resistance test of NAA. NAA <50>is the most important component in the induction of NAA. The activity of NAA is about 1/6 lower than that of NAA. The basic structure of NAA is composed of carbon and hydrogen. The final concentration of these substances is 10^<-4>M, and the root elongation is <-5>inhibited. The gravity response of the root is abnormal. The low concentration of these substances is the possibility of inhibiting the transport of these substances. The hydrolysis products of one side and one side are 10^<-5>M in diameter, and the elongation of the roots is inhibited. In the future, this kind of compound can be divided into three parts. 2)An improved yeast Three-hybrid method was developed to enhance the sensitivity of the yeast to the target and to enhance the interaction between the receptor and the Dex. The Three-hybrid method was used to construct a novel Three-hybrid method. Dex NTA bridging complex (Dex-NTA) and cell membrane permeability His-tag addition to GAL4-BD and GAL4-AD is responsible for the development of fusion protein in yeast cells and for the activation of fusion protein in yeast cells. Now, the structure of the product, the length of the product, the activation of the product, and the conditions for the activation of the product.