酵母Three-Hybridシステムによる植物ホルモン受容体のクローニング

利用酵母三杂交系统克隆植物激素受体

基本信息

批准号：
11760093
负责人：
水谷正治
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2000
项目状态：
已结题

项目摘要

酵母Three-hybrid法は、低分子リガンド(bait)とタンパク質の相互作用を酵母細胞内で検出し、リガンド受容体候補遺伝子をcDNAライブラリーから直接クローニングする方法である。本研究では、baitとして用いるオーキシンリガンドの合成とその生理活性の検討を行った。またスクリーニングの感度を向上させる目的でThree-hybrid法の改良を試みた。1)オーキシンリガンドの合成と生理活性;まずデキサメタソン(Dex)との架橋を目的とし、NAAの構造活性相関を化合物のオーキシン活性をシロイヌナズナの根の伸長阻害試験により評価した。NAAのアセトキシメチルエステル誘導体は生体内で速やかに加水分解されるためNAAと同等の活性を持つこと、一方NAAのメチルエステルはIC_<50>にしてNAAの約1/6に低下することから、活性にはカルボキシル基が重要であることが判った。そこでNAAを基本骨格として側鎖メチレン基から炭素鎖を伸ばしてDexと架橋可能な官能基を導入した化合物を合成した。そのメチルエステル体は最終濃度10^<-4>Mで顕著に根の伸長を阻害し、10^<-5>Mでは根の重力応答に異常を与えたことから、低濃度ではオーキシンとしてよりもむしろオーキシン輸送の阻害剤として作用している可能性が示唆された。一方、その加水分解物は10^<-5>Mで顕著に根の伸長を阻害し強いオーキシン活性を示した。今後、この化合物を元にオーキシンリガンド創製を目指す。2)酵母Three-hybrid法の改良;スクリーニング感度の向上を目的とし、グルココルチコイド受容体とDexとの相互作用よりもさらに強固なNi-NTAとHis-tag相互作用をThree-hybrid法に応用した新しいスクリーニング法の構築を試みた。Dexとニトリロ三酢酸(NTA)を架橋した複合体(Dex-NTA)およびその細胞膜透過性を向上させたアセトキシメチルエステル誘導体を合成した。His-tagを付加したGAL4-BDおよびGAL4-ADとグルココルチコイド受容体との融合タンパク質を発現させた酵母をリガンド添加培地上で培養したが、リガンドに依存したレポーター遺伝子の転写活性化は検出されなかった。現在リガンドの構造、スペーサーの長さも含めてレポーター遺伝子の転写活性化が起こる条件を引き続き検討している。

酵母三杂化方法检测到酵母细胞和克隆候选配体受体基因的小分子配体（诱饵）和蛋白质之间的相互作用直接从cDNA文库中。在这项研究中，我们研究了用作诱饵及其生理活性的生长素配体的合成。我们还试图改善三杂交方法，以提高筛选的灵敏度。 1）生长素配体的合成和生理活性；首先，对于与地塞米松（DEX）的交联，NAA的结构活性关系通过该化合物的生长素活性通过拟南芥根延伸抑制测试评估。 NaA的乙酰氧甲基酯衍生物在体内迅速水解，并且具有相当于NaA的活性，而NaA的甲基酯变为IC_ <50>，降低至NAA的约1/6，表明羧基对其活性很重要。因此，合成了一个化合物，其中使用NAA作为碱性主链引入了能够与DEX进行交联的官能团，从而从侧链甲基甲基组中扩展了碳链。甲基酯在10^<-4> m的最终浓度下显着抑制了根部伸长，并且在10^<-5> m处引起根部重力反应的异常，这表明它可以充当生长素转运的抑制剂，而不是低浓度下的生长素。另一方面，水解产物在10^<-5> m处显着抑制根部伸长，并显示出强大的生长素活性。将来，我们旨在使用该化合物创建辅助配体。 2）改进酵母三杂交方法；为了提高筛选敏感性，我们尝试构建一种新的筛选方法，该方法将Ni-NTA和HIS-TAG相互作用应用于三杂化方法，该方法甚至比糖皮质激素受体和DEX之间的相互作用更强。合成了一种复杂的（DEX-NTA），在Dex和硝基三环酸（NTA）和乙酰氧基甲基酯衍生物之间进行了交联，该复合物合成了其细胞膜渗透性。在配体添加的培养基上培养了与HIS标签一起表达GAL4-BD和GAL4-AD之间融合蛋白的酵母菌，但未检测到记者基因的配体依赖性转录激活。当前，继续研究了记者基因的转录激活条件，包括配体的结构和垫片的长度。