酵母Three-Hybridシステムによる植物ホルモン受容体のクローニング

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酵母Three-hybrid法は、低分子リガンド(bait)とタンパク質の相互作用を酵母細胞内で検出し、リガンド受容体候補遺伝子をcDNAライブラリーから直接クローニングする方法である。本研究では、baitとして用いるオーキシンリガンドの合成とその生理活性の検討を行った。またスクリーニングの感度を向上させる目的でThree-hybrid法の改良を試みた。1)オーキシンリガンドの合成と生理活性;まずデキサメタソン(Dex)との架橋を目的とし、NAAの構造活性相関を化合物のオーキシン活性をシロイヌナズナの根の伸長阻害試験により評価した。NAAのアセトキシメチルエステル誘導体は生体内で速やかに加水分解されるためNAAと同等の活性を持つこと、一方NAAのメチルエステルはIC_<50>にしてNAAの約1/6に低下することから、活性にはカルボキシル基が重要であることが判った。そこでNAAを基本骨格として側鎖メチレン基から炭素鎖を伸ばしてDexと架橋可能な官能基を導入した化合物を合成した。そのメチルエステル体は最終濃度10^<-4>Mで顕著に根の伸長を阻害し、10^<-5>Mでは根の重力応答に異常を与えたことから、低濃度ではオーキシンとしてよりもむしろオーキシン輸送の阻害剤として作用している可能性が示唆された。一方、その加水分解物は10^<-5>Mで顕著に根の伸長を阻害し強いオーキシン活性を示した。今後、この化合物を元にオーキシンリガンド創製を目指す。2)酵母Three-hybrid法の改良;スクリーニング感度の向上を目的とし、グルココルチコイド受容体とDexとの相互作用よりもさらに強固なNi-NTAとHis-tag相互作用をThree-hybrid法に応用した新しいスクリーニング法の構築を試みた。Dexとニトリロ三酢酸(NTA)を架橋した複合体(Dex-NTA)およびその細胞膜透過性を向上させたアセトキシメチルエステル誘導体を合成した。His-tagを付加したGAL4-BDおよびGAL4-ADとグルココルチコイド受容体との融合タンパク質を発現させた酵母をリガンド添加培地上で培養したが、リガンドに依存したレポーター遺伝子の転写活性化は検出されなかった。現在リガンドの構造、スペーサーの長さも含めてレポーター遺伝子の転写活性化が起こる条件を引き続き検討している。