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植物ホルモン活性化/不活性化機構の分子基盤-ブラシノステロイド生合成・代謝酵素による制御-

植物激素激活/失活机制的分子基础 - 油菜素类固醇生物合成和代谢酶的控制 -

基本信息

批准号：
13024243
负责人：
水谷正治
金额：
$ 2.3万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

今年度は、ブラシノステロイド不活性化に関わるP450を酵素化学的に解析することを中心として実験を進めた。これまでにトマトからブラシノステロイド生合成に関わるP450(CYP90A, B, C)と不活性化に関わる新規CYP72B2および72B3の全長cDNAを単離した。トマトをブラシノステロイド処理すると生合成遺伝子の転写量は減少したのに対し、CYP72B2および72B3の転写は増加した。また72B2cDNAをタバコで過剰発現させたところ矮性表現型を示した。内生ブラシノステロイド含量をGC-MSにより定量し野生株と比較したところ、組換え体においてカスタステロンが顕著に減少していたことから、過剰発現している72B2がカスタステロンを不活性化したために矮化していることが示唆された。昆虫細胞ムバキュロウイルス発現系により作製した72B2酵素を用いて生合成中間体に対する基質結合アッセイを行った結果、72B2はカスタステロンに対して強い親和性(6μM)を示したが、一方、活性型ブラシノライドや生合成前駆体6-デオキソカスタステロンはやや弱い親和性(11μM)しか示さなかった。そこで、72B2酵素を発現している昆虫細胞のミクロソーム膜を用いてNADPH-P450還元酵素共存のもとで代謝実験を行った。カスタステロンを基質として酵素アッセイを行った結果、GC-MSにより水酸化生成物を検出する事ができた。MS解裂パターンからカスタステロンの側鎖に水酸基が一つ導入されていることが示された。現在、生成物を分取してNMRによる構造解析を進めている。

This year, the enzyme activity of P450 is related to the enzyme activity of the enzyme. Here, the full-length cDNAs of the new regulations CYP72B2 and 72B3, which are related to the synthesis and inactivation of P450(CYP90A, B, C), were separated. The number of copies of CYP72B2 and CYP72B3 has decreased since the beginning of the study. 72 B2 cDNA was detected by PCR and its expression was detected by PCR. GC-MS is used to quantify and compare the content of endogenous plant species with that of wild plant species, and the content of endogenous plant species with that of wild plant species with that of wild plant species. Insect cell culture system was developed using 72B2 enzyme as substrate binding agent. 72B2 enzyme showed strong affinity (6μM) for substrate synthesis intermediate. 72B2 enzyme showed weak affinity (11μM) for substrate synthesis precursor. 72B2 enzyme is produced in insect cells and used in the metabolism of NADPH-P450 enzyme. GC-MS is the most important enzyme in the world. MS is a new type of polymer. It is a new type of polymer. Now, the product is separated and NMR is analyzed.