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植物テルペノイド生合成酵素のオペロン様遺伝子クラスターの解明

植物萜类生物合成酶类操纵子基因簇的阐明

基本信息

批准号：
15780086
负责人：
水谷正治
金额：
$ 2.24万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、シロイヌナズナゲノム上クラスターを形成するテルペン環化酵素とP450遺伝子が植物テルペノイド生合成経路上でも密接に関連していることを実験的に証明することを目指す。今年度は、(1)各遺伝子発現様式のデータベース解析、(2)バキュロウイルス昆虫細胞系によるP450の組み換え酵素の作成、(3)モデル酵素を利用したアッセイ系の確立、を行った。またシロイヌナズナ以外の植物でも同様の事象を検証するため(4)イネゲノム上のテルペン環化酵素とP450遺伝子クラスターの解析を行った。(1)理研、マックスプランクおよびABRCから提供されているマイクロアレイデータベースを利用して発現様式を解析した。遺伝子クラスターを形成する各遺伝子は各ホルモンおよびストレス処理下でも協調して発現していた。根で発現しているクローンの多くはジャスモン酸によっても協調的に発現が誘導されていた。これらの事実からクラスターを形成するP450とテルペン合成酵素遺伝子は同じ転写制御を受けている可能性が高いと思われる。(2)CYP706A3,CYP705A1,CYP716A1,CYP708A2,CYP71A16,CYP708A3の各P450 cDNAをpFastBac1発現ベクターに挿入し昆虫細胞Sf9に導入して各組み換えウイルスを作成した。SDS-PAGEにより組み換え酵素の発現を確認した後、C0差スペクトルを測定することにより、活性型P450の発現を確認した。今回、CYP706A3、CYP716A1、CYP71A16、CYP708A3の活性型P450を調製することができた。(3)アブシジン酸の代謝するCYP707A、またステロールを代謝するCYP90BおよびCYP710Aを用いて、in vitroアッセイ系のモデル実験を行った。昆虫細胞ミクロソームに基質を加えることによりP450活性を検出できることが確認できた。これは昆虫細胞由来のP450還元酵素が植物P450に電子伝達できることを示している。(4)イネゲノムを検索した結果、ジテルペン型ファイトアレキシンの生成に関わるジテルペン環化酵素遺伝子とP450(CYP71Zs,CYP76Ms,CYP99As)がイネゲノム上でクラスターを形成していることが分かった。これらのP450はファイトカサンおよびモミラクトン生成に関わる酸化反応を触媒している可能性が高いと思われる。

This study demonstrates the relationship between cycloenzyme and P450 gene in plant biosynthesis pathway. This year,(1) the analysis of the expression pattern of each gene,(2) the preparation of P450 enzyme for the production of insect cell lines,(3) the establishment and implementation of P450 system for the utilization of enzyme. The analysis of the enzyme and P450 gene of the plant species other than the plant species is carried out. (1)RIKEN and ABRC provide analysis of the development model by using the model. The formation of the gene is coordinated by the gene processing. The root cause of the disease is the occurrence of multiple diseases. The P450 and P450 of these enzymes are highly likely to be produced in the same way as the P450 of the enzyme. (2) P450 cDNA of CYP706A3, CYP705A1, CYP716A1, CYP708A2, CYP71A16, CYP708A3 was introduced into insect cell Sf9 by pFastBac1. After SDS-PAGE, the detection of C0 and P450 was confirmed. This time, the active forms of P450 of CYP706A3, CYP716A1, CYP71A16, and CYP708A3 will be modulated. (3)CYP707A, CYP90B, CYP710A, CYP907A, CYP907B, CYP907A, CYP907B, CYP907A, CYP907A, CYP907B, CYP907A, CYP907A, CYP907B, CYP90707A, CYP907B, CYP9070B, CYP9070A, CYP90707A, CYP90707B, CYP90707B, CYP90707A, CYP9070B, CYP90707B, CYP90707A, CYP9070B, CYP9070B, CYP9070B, Insect cell matrix is added to the P450 activity. This is an indication that the P450 reducing enzyme derived from insect cells can be electronically transmitted from plant P450. (4)As a result of this research, the cycloenzyme P450(CYP71Zs, CYP76Ms, CYP99As) was found to be involved in the formation of cycloenzymes. The P450 is highly probable for acidification reactions.