植物ホルモン活性化/不活性化機構の分子基盤-ブラシノステロイド生合成/代謝酵素による制御-

植物激素激活/失活机制的分子基础 - 油菜素类固醇生物合成/代谢酶的控制 -

基本信息

批准号：
12045238
负责人：
水谷正治
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

ブラシノステロイド(BR)生合成・代謝経路には多数のチトクロムP450酵素が関与している。本研究では、BR活性化/不活性化に関与するP450酵素を単離同定し、その発現制御機構を解析することによりBR分子の作用部位における経時的消長を遺伝子、酵素レベルで解析しBRの生理機能の分子基盤を解明することを目的とする。A.cDNAクローニング:相同性検索によりBR生合成・代謝に関与する可能性の高いと推定された候補P450遺伝子をシロイヌナズナおよびトマトからクローニングした。シロイヌナズナから14クローン、トマトから8クローンの全長cDNAを単離した。B.BR応答性の検討:シロイヌナズナおよびトマトを用いて、BR処理、BR生合成阻害剤処理による各遺伝子の転写変動を検討した。BR添加によりCYP90、CYP708ファミリーに属する各遺伝子は発現が抑制され、逆に阻害剤により発現が増加したことから、これらの遺伝子はBR生合成に関与していることが示唆された。またトマトCYP72B2はBR処理により発現が増加しBR代謝に関わっている可能性が示唆された。C.組み替え酵素の発現:候補P450の組み替え酵素を発現させるための予備検討を大腸菌を用いて行った結果、一部の分子種は大量に発現するものの発現しない分子種も多く、またN末領域のアミノ酸配列を改変する必要があるため発現ベクターの構築にも多大な労力を要することが予想された。そこで、より安定して多量のP450を発現することが可能で、かつ全長cDNAをそのまま組み込むことができるバキュロウイルスー昆虫細胞発現系を用いて上記候補P450の発現を行うこととした。pFastBacl発現ベクターに各P450の全長cDNAを組み込み昆虫細胞を用いて発現させた結果、全てのP450について発現タンパク質由来のバンドをSDS-PAGE上で確認することができた。そこで培地にヘムの前駆物質を加えて昆虫細胞を培養しウイルス感染を行ったところ、ほとんどのP450について活性型酵素を検出した。

大量的细胞色素P450酶参与了腕足（BR）生物合成和代谢途径。这项研究旨在隔离和鉴定与BR激活/失活有关的P450酶，并分析其表达控制机制，从而分析BR分子在基因和酶水平上的时间相关的下降和生长，并阐明BR的物理功能的分子基础。 A. cDNA克隆：候选P450基因被认为是通过拟南芥和西红柿克隆的。分离了来自拟南芥的14个克隆的全长cDNA和来自西红柿的8个克隆。 B. BR反应性检查：使用拟南芥和番茄，通过BR治疗和BR生物合成抑制剂处理研究了每个基因的转录变化。 BR的添加抑制了属于CYP90和CYP708家族的基因的表达，相反，抑制剂增加了表达，这表明这些基因与BR生物合成有关。此外，有人提出，由于BR治疗可能与BR代谢有关，番茄CYP72B2的表达增加。 C.重组酶的表达：使用大肠杆菌对候选P450表达重组酶进行初步研究，并且可以预测，尽管某些分子物种大量表达，但其中许多人并未表达，并且由于N-Term-terminal区域的氨基酸序列需要改变效果，因此需要更改。因此，使用杆状病毒insect的细胞表达系统进行了候选P450的表达，该细胞表达系统允许P450的更稳定表达，并可以直接掺入全长的cDNA。将每个P450的全长cDNA整合到PfastBaCl表达载体中并使用昆虫细胞表达，并在所有P450的SDS-PAGE上证实了源自表达蛋白的条带。因此，将血红素前体添加到培养昆虫细胞的培养基中，并进行病毒感染，并在大多数P450中检测到活性酶。