植物ホルモン活性化/不活性化機構の分子基盤-ブラシノステロイド生合成/代謝酵素による制御-

植物激素激活/失活机制的分子基础 - 油菜素类固醇生物合成/代谢酶的控制 -

• 批准号: 12045238
• 负责人: 水谷 正治
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12045238/
• 关键词: ブラシノステロイド; チトクロムP450; 植物ホルモン; バキュロウイルス; シロイヌナズナ

ブラシノステロイド(BR)生合成・代謝経路には多数のチトクロムP450酵素が関与している。本研究では、BR活性化/不活性化に関与するP450酵素を単離同定し、その発現制御機構を解析することによりBR分子の作用部位における経時的消長を遺伝子、酵素レベルで解析しBRの生理機能の分子基盤を解明することを目的とする。A.cDNAクローニング:相同性検索によりBR生合成・代謝に関与する可能性の高いと推定された候補P450遺伝子をシロイヌナズナおよびトマトからクローニングした。シロイヌナズナから14クローン、トマトから8クローンの全長cDNAを単離した。B.BR応答性の検討:シロイヌナズナおよびトマトを用いて、BR処理、BR生合成阻害剤処理による各遺伝子の転写変動を検討した。BR添加によりCYP90、CYP708ファミリーに属する各遺伝子は発現が抑制され、逆に阻害剤により発現が増加したことから、これらの遺伝子はBR生合成に関与していることが示唆された。またトマトCYP72B2はBR処理により発現が増加しBR代謝に関わっている可能性が示唆された。C.組み替え酵素の発現:候補P450の組み替え酵素を発現させるための予備検討を大腸菌を用いて行った結果、一部の分子種は大量に発現するものの発現しない分子種も多く、またN末領域のアミノ酸配列を改変する必要があるため発現ベクターの構築にも多大な労力を要することが予想された。そこで、より安定して多量のP450を発現することが可能で、かつ全長cDNAをそのまま組み込むことができるバキュロウイルスー昆虫細胞発現系を用いて上記候補P450の発現を行うこととした。pFastBacl発現ベクターに各P450の全長cDNAを組み込み昆虫細胞を用いて発現させた結果、全てのP450について発現タンパク質由来のバンドをSDS-PAGE上で確認することができた。そこで培地にヘムの前駆物質を加えて昆虫細胞を培養しウイルス感染を行ったところ、ほとんどのP450について活性型酵素を検出した。

Most of the enzymes involved in the biosynthetic and metabolic pathways are called P450 enzymes. This study aims to elucidate the molecular basis for BR physiological function by analyzing the molecular basis for the identification and regulation of P450 enzymes related to BR activation/inactivation, and the evolution of BR molecular sites. A.cDNA library: identity model, biosynthetic, metabolic, and related high likelihood of putative candidate P450 library The full-length cDNA of the gene is isolated from the gene. B.BR response analysis: BR process, BR synthesis inhibitor process, each component's response analysis The addition of CYP90, CYP708, and other genes inhibits and inhibits the production of these genes. CYP72 B2 increases the likelihood of BR metabolism. C. Development of a group of alternative enzymes: candidate P450 for development of an alternative enzyme, preparation of a preliminary study of Escherichia coli, results of a large number of molecular species, development of a large number of molecular species, and changes in acid alignment in the N terminal domain. The expression of P450 is stable and stable. The expression of P450 is stable and stable. The expression of P450 is stable and stable. The full-length cDNA of each P450 in pFastBacl was assembled in insect cells and the results were confirmed on SDS-PAGE. The P450 enzyme was detected in the culture of insect cells.